七株富硒乳酸菌的功能特性評(píng)價(jià)及其抗氧化活性

許牡丹， 賀佳璇， 徐 穎， 鄔淑芳， 張 婷

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

乳酸菌是一種存在于人體內(nèi)的益生菌，被應(yīng)用于食品及藥品行業(yè)，一般用來(lái)做發(fā)酵食品、保健食品及相關(guān)藥品等[1].硒是人體必需的微量元素，能提高人體的免疫力，在抗癌、抗氧化等方面都具有相應(yīng)的功效[2].生物氧化是有機(jī)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)氧化分解產(chǎn)生二氧化碳、水，并釋放出大量能量的過(guò)程.機(jī)體可通過(guò)膳食攝入抗氧化物質(zhì)，提高機(jī)體抗氧化能力，然而化學(xué)抗氧化劑仍存在安全問(wèn)題，達(dá)到一定量將損害人體生理機(jī)能.

乳酸菌的主要抗氧化成分為抗氧化多肽，是一種天然抗氧化劑.植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、短乳桿菌、干酪乳桿菌等幾種屬于乳酸菌的菌種都具有富集硒的能力[3-6].研究表明，鹽脅迫和熱脅迫可以促進(jìn)鼠李糖乳桿菌富硒能力.富硒乳酸菌可以作為一種添加物添加到功能食品中，在富硒食品的生產(chǎn)過(guò)程中要控制加入的量[7].

不同種屬乳酸菌富硒能力不同[5].Yang等[8]探究發(fā)現(xiàn)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌對(duì)硒的積累量分別達(dá)到12.05±0.43μg/mL和11.56±0.25μg/mL，富硒乳酸菌比對(duì)照具有更強(qiáng)的抗菌活性.實(shí)驗(yàn)評(píng)估了5株食品級(jí)乳酸桿菌菌株的益生菌潛力，顯示出在pH為2的模擬胃液中存活的能力，這些培養(yǎng)物也在含有1%膽汁鹽的模擬腸液中存活[9].研究發(fā)現(xiàn)從不同食物中篩選出的乳酸菌其特性不同，來(lái)自開(kāi)菲爾粒的菌株在抗菌活性和膽汁鹽脫除方面有更好的特性，來(lái)自原料乳的菌株具有更好的疏水性和抗氧化特性[10].通過(guò)富硒提高乳酸菌抗氧化活性，對(duì)天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)有重要意義.在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取了7株乳酸菌對(duì)其進(jìn)行體外功能特性評(píng)定，為富硒乳酸菌及其富硒食品的研發(fā)提供理論和實(shí)踐依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌(ATCC 53103，LGG)、嗜熱鏈球菌(BNCC 335885，ST)、嗜酸乳桿菌(ZK-AS 1.2686，LA)、保加利亞乳桿菌(ZK-GIM 1.155，LB)、羅伊氏乳桿菌(ATCC 23272，LR)、干酪乳桿菌(ZK-AS 1.1482，LC)、植物乳桿菌(ATCC 8014，LP)由實(shí)驗(yàn)室提供；亞硒酸鈉，山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司.其他試劑均為常見(jiàn)分析純.

1.2 儀器

722E型分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)多功能掃描讀數(shù)儀，賽默飛世爾科技有限公司；其他均為實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)儀器.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將冷凍保存的各菌株接種于MRS中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，再活化兩次.

1.3.2 富硒乳酸菌功能特性評(píng)估

將活化好的乳酸菌分別接種于含亞硒酸鈉和不含亞硒酸鈉的液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，4 000 r/min 離心5 min.菌體用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)洗滌，用生理鹽水重懸并調(diào)整菌數(shù)為 1×109CFU/mL，制成菌懸液.

(1)菌株疏水性測(cè)定

調(diào)節(jié)菌液濃度使A600的值為0.5.將3 mL乳酸菌懸液加入到1 mL二甲苯、三氯甲烷和十六烷中，劇烈渦旋2 min.靜置30 min后取水相，測(cè)量水相的A600值，并與初始值進(jìn)行比較.按式(1)計(jì)算疏水性:

(1)

(2)體外模擬胃腸液存活率試驗(yàn)

將稀釋好的菌液加入模擬胃液中，37 ℃培養(yǎng)，在1 h、2 h、3 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù).3 h后，取每個(gè)菌懸液，加入相同體積的腸液.在 37 ℃下培養(yǎng)，在1 h和3 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù).存活率以不同時(shí)間的CFU/mL與0 h的CFU/mL的百分比計(jì)算.

(3)菌株降膽固醇能力測(cè)定

將菌液加入MRS-膽固醇培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)24 h，并做空白組實(shí)驗(yàn).采用鄰苯二甲醛法對(duì)乳酸菌降膽固醇能力進(jìn)行測(cè)定[11].

1.3.3 富硒乳酸菌抗氧化能力測(cè)定[12]

分別收集發(fā)酵上清液及沉淀菌體，將1.3.2得到的菌懸液分為兩組，一組為菌懸液組，另一組用于胞內(nèi)無(wú)細(xì)胞提取物(CFE)的制備.將乳酸菌菌懸液冰浴超聲波破碎細(xì)胞(工作2 s 間歇1 s，輸出功率100 w)10 min后，在4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集上清液，即為CFE.

(1) DPPH自由基清除率

將2 mL上清液、菌懸液或CFE和2 mL的0.2 mmol/L DPPH·無(wú)水乙醇溶液混合，并在黑暗中反應(yīng)30 min.通過(guò)測(cè)量517 nm處吸光度的降低來(lái)監(jiān)測(cè)DPPH清除率.空白組以等體積無(wú)水乙醇代替DPPH溶液，對(duì)照組以無(wú)菌水代替樣品.按式(2)計(jì)算清除率:

(2)

式(2)中：Ai-樣品組的吸光度;Aj-空白組的吸光度;A0-對(duì)照組的吸光度.

(2)羥自由基清除率

將0.5 mL 1,10-鄰菲羅啉(6 mmol/L)與1 mL PBS(pH 7.2)混合，混勻后加入0.5 mL硫酸亞鐵(6 mmol/L)，立即混勻，加0.5 mL樣品后加入0.5 mL 過(guò)氧化氫(0.1%)和無(wú)菌水，最終總體積為4 mL.混合物在37 ℃孵育1 h，同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn).在536 nm處讀取吸光值.使用式(3)計(jì)算羥自由基(OH-)清除能力:

(3)

式(3)中：AS-樣品吸光度；A1-有1,10-鄰菲羅啉、硫酸亞鐵和H2O2的對(duì)照溶液吸光度；A0-有1,10-鄰菲羅啉和硫酸亞鐵的空白溶液吸光度.

(3)超氧陰離子自由基清除率

將0.1 mL樣品與4.5 mL、pH 8.0的Tris-HCl緩沖液混合，25 ℃水浴20 min后，加入0.4 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚，于25 ℃水浴反應(yīng)5 min，立即用2滴8 mol/L的HCl 終止反應(yīng)，在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光值即為A，用蒸餾水調(diào)零.空白組用無(wú)菌水代替樣品即為A0，按式(4)計(jì)算清除率：

(4)

1.3.4 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和硫氧還蛋白還原酶活性測(cè)定

谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性按照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行測(cè)定.硫氧還蛋白還原酶活性采用硫氧還蛋白還原酶ELISA測(cè)定試劑盒(上海通蔚科技有限公司)，按照說(shuō)明操作.

2 結(jié)果與討論

2.1 富硒乳酸菌功能特性評(píng)估

2.1.1 菌株疏水性測(cè)定

疏水性是益生菌細(xì)胞粘附腸道上皮細(xì)胞的重要指標(biāo)之一，疏水性越高，益生菌粘附特性越好[14].脂蛋白可能影響革蘭氏陰性菌的表面疏水性[15]，通過(guò)利用表面疏水性和其他特性可以篩選出最佳益生菌特性的菌株.由圖1可知，菌液與不同的有機(jī)溶劑疏水性大小依次為：三氯甲烷>十六烷>二甲苯.富硒后除保加利亞乳桿菌外其他菌株對(duì)二甲苯的疏水性都有提高，保加利亞乳桿菌的疏水性最大為17.33±0.27%，與空白組相比提高了6.75%.鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌富硒后對(duì)三氯甲烷的疏水性都有提高，其中羅伊氏乳桿菌的疏水性最大為30.88±0.41%，提高了0.35%.干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌富硒后對(duì)十六烷的疏水性都有提高，羅伊氏乳桿菌的疏水性最大為47.88±0.39%，提高了18.95%.

圖1 乳酸菌富硒前后疏水性

2.1.2 體外模擬胃腸液存活率

由表1可知，不同培養(yǎng)時(shí)間菌株的存活率不同，富硒培養(yǎng)使不同時(shí)間活菌數(shù)有所提高.在模擬胃液中1 h后，菌株存活率較高，鼠李糖乳桿菌存活率最高為96.41±0.71%，嗜熱鏈球菌通過(guò)富硒存活率提高，是空白組的1.06倍.2 h后，富硒嗜酸乳桿菌與空白組相比提高了5.75%.3 h后，富硒乳酸菌相比空白組存活率較高，植物乳桿菌提高最大，是空白組的1.09倍.在模擬腸液中1 h后，七株菌株存活率較高，嗜酸乳桿菌富硒后提高了3.21%.3 h后，乳酸菌存活率仍然較高，鼠李糖乳桿菌存活率最高為73.34±0.96%，是空白組的1.02倍.乳酸菌對(duì)胃腸環(huán)境的耐受性和對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附與luxS/AI-2有關(guān)，研究表明了luxS基因在植物乳桿菌KLDS1.0391的抗逆性和粘附能力中的作用[16].由于菌株的特異性，不同菌株對(duì)胃腸液的耐受性存在顯著差異(P<0.05)，因此，通過(guò)體外模擬胃腸道環(huán)境篩選高存活率益生菌具有重要意義[17].

表1 七株乳酸菌富硒培養(yǎng)前后體外模擬胃腸液存活率測(cè)定

2.1.3 降膽固醇能力測(cè)定

由圖2可知，富硒培養(yǎng)后鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌的膽固醇去除率沒(méi)有發(fā)生明顯變化，其余菌株都有顯著提高，嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌去除率較高，分別為83.33±1.73%和81.21±1.05%，是空白組的1.04倍.干酪乳桿菌去除率提高最大，與空白組相比提高了13.76%，實(shí)驗(yàn)表明富硒可以提高部分乳酸菌的降膽固醇能力.Rossi等[18]認(rèn)為膽固醇通過(guò)摻入細(xì)胞膜方式，從而改變細(xì)胞膜的韌性.Wang等[19]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌顯著降低了大鼠血清總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇.

圖2 乳酸菌富硒前后膽固醇去除率

2.2 乳酸菌抗氧化能力測(cè)定

由圖3可知，富硒培養(yǎng)對(duì)所有菌株發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除率都有顯著提高，植物乳桿菌提高最大，與空白組相比提高了14.04%.除保加利亞乳桿菌外，富硒對(duì)所有菌株菌懸液的DPPH自由基清除率都有顯著提高，鼠李糖乳桿菌提高最大，與空白組相比提高了10.46%.富硒培養(yǎng)對(duì)所有菌株CFE的DPPH自由基清除率都有顯著提高，其中干酪乳桿菌提高最大為28.62±0.68%，是空白組的1.89倍.

(a)上清液

(b)菌懸液

(c)CFE圖3 乳酸菌不同組分DPPH自由基清除率

由圖4可知，富硒培養(yǎng)對(duì)所有菌株發(fā)酵上清液的羥自由基清除率都有顯著提高，羅伊氏乳桿菌提高最大為80.28±1.32%，與空白組相比提高了37.85%，富硒培養(yǎng)后鼠李糖乳桿菌和保加利亞乳桿菌的清除率最高，分別為89.72±0.98%和87.48±0.79%.富硒對(duì)大部分菌株菌懸液的羥自由基自由基清除率有顯著提高，其中干酪乳桿菌提高最大，提高了7.97%，嗜酸乳桿菌清除率最高為46.92±0.88%.富硒培養(yǎng)大部分菌株CFE的羥自由基清除率有顯著提高，鼠李糖乳桿菌提高最大，與空白組相比提高了10.46%，同時(shí)清除率最高為42.7±0.93%.

(a)上清液

(b)菌懸液

(c)CFE圖4 乳酸菌不同組分羥自由基清除率

由圖5可知，富硒培養(yǎng)對(duì)所有菌株發(fā)酵上清液的超氧陰離子自由基清除率都有顯著提高，植物乳桿菌提高最大，是空白組的1.55倍.保加利亞乳桿菌的清除率最高為83.94±1.05%，是空白組的1.21倍.富硒對(duì)大部分菌株菌懸液的超氧陰離子自由基清除率有顯著提高，嗜酸乳桿菌提高最大，與空白組相比提高了28.86%，嗜熱鏈球菌的清除率最高，達(dá)到72.72±1.21%，是空白組的1.18倍.CFE的超氧陰離子自由基清除率有顯著提高，鼠李糖乳桿菌提高最大，是空白組的1.81倍.植物乳桿菌的清除率最高為24.8±0.54%.

(a)上清液

(b)菌懸液

(c)CFE圖5 乳酸菌不同組分超氧陰離子 自由基清除率

由于不同的菌株其清除羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基能力的不同，所以其抗氧化機(jī)制有所差異[20]，劉洋等[21]的研究也反映出這一點(diǎn).由結(jié)果可知七株乳酸菌抗氧化能力各不相同，可能是起抗氧化作用的活性物質(zhì)本質(zhì)或濃度不同，推測(cè)其可能為不同抗氧化酶類[13].同一株乳酸菌的菌懸液、上清液及CFE的抗氧化能力也存在較大差異，說(shuō)明富集的硒及受硒影響的抗氧化活性物質(zhì)(酶)可能主要存在于菌體表面或內(nèi)部，通過(guò)富硒影響相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而影響酶活力[22].

2.3 谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和硫氧還蛋白還原酶活性

由圖6可知，七株乳桿菌富硒后的GSH-Px活性都有提高，其中鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和嗜酸乳桿菌提高顯著，分別是空白組的1.14、1.35和1.21倍.

富硒可促進(jìn)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生，硒添加量與GSH-Px活性有關(guān)聯(lián)，即在一定范圍內(nèi)乳酸菌的GSH-Px活性隨著硒添加濃度的增加而增加，當(dāng)亞硒酸鈉濃度升高到一定程度時(shí)，GSH-Px活性略有降低.硒是GSH-Px 的催化位點(diǎn)中的硒代半胱氨酸合成的必要元素，可能是由于當(dāng)亞硒酸鈉濃度過(guò)高時(shí)，抑制硒代半胱氨酸的合成，從而不會(huì)使GSH-Px活性持續(xù)增加.Tang等[22]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LactobacillusplantarumMA2發(fā)酵上清液和細(xì)胞勻漿均表現(xiàn)出谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性.

由圖7可知，鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌富硒培養(yǎng)后其TrxR活性略有降低.干酪乳桿菌和羅伊氏乳桿菌的TrxR活性有提高，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌的TrxR活性有較大提高，空白組分別為3.46±0.35 mU/L、4.23±0.37 mU/L和5.92±0.49 mU/L，富硒培養(yǎng)后分別是空白組的1.32、1.29和1.11倍.七株菌株中，植物乳桿菌的TrxR活性最大為6.57±0.38 mU/L.

硫氧還蛋白系統(tǒng)與體內(nèi)細(xì)胞氧化還原反應(yīng)、核酸代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)及腫瘤發(fā)生有關(guān)[23].五株乳酸菌酶活有提高，兩株乳酸菌酶活有略微下降.硫氧還蛋白還原酶的活性與體內(nèi)硒含量密切相關(guān)[24]，雖然該酶是含硒酶，但不是所有乳酸菌經(jīng)過(guò)富硒培養(yǎng)一定能提高其酶活.酶活性降低可能是由于富硒能力較低，只能轉(zhuǎn)化少部分亞硒酸鈉生成單質(zhì)硒，亞硒酸鈉的存在可能會(huì)影響酶的合成.

圖6 七株富硒乳酸菌的GSH-Px活性

圖7 七株富硒乳酸菌的TrxR活性

3 結(jié)論

對(duì)不同種屬乳酸菌的功能特性進(jìn)行測(cè)定，探究富硒乳酸菌的疏水性、模擬胃腸液存活力等特性，通過(guò)自由基清除實(shí)驗(yàn)對(duì)七株乳酸菌富硒前后的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)比較，并測(cè)定GSH-Px和TrxR活性.疏水性結(jié)果表明，乳酸菌富硒可以提高其疏水性.模擬胃腸液存活率和膽固醇去除率測(cè)定結(jié)果表明，相比于空白組，乳酸菌存活和膽固醇去除率有所提高.抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，富硒乳酸菌在 DPPH自由基清除率、羥自由基清除率等方面有顯著提高.通過(guò)測(cè)定GSH-Px及TrxR活性，探究富硒對(duì)起抗氧化作用的物質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)富硒可以提高乳酸菌兩種酶活力.本研究對(duì)不同種屬的富硒乳酸菌生物活性進(jìn)行基礎(chǔ)性的體外測(cè)試，然而，對(duì)于其具體作用機(jī)理和其他抗氧化物質(zhì)有待進(jìn)一步探究和闡明.