大孔樹(shù)脂純化平臥菊三七總有機(jī)酸工藝研究

趙玉榮，曾 銳，張藝蓉，陸姍姍

（南京中醫(yī)藥大學(xué)翰林學(xué)院，江蘇泰州 225300）

0 引言

平臥菊三七Gynura procumbens Lour.為菊三七屬多年生草本植物，具有降糖、降血脂、抗氧化等功效［1-3］，有研究表明總有機(jī)酸是其抗氧化作用的有效組分之一［4］。前期研究發(fā)現(xiàn)平臥菊三七中抗氧化成分主要集中在乙酸乙酯部位，并通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定了其主要含有有機(jī)酸類(lèi)成分，如綠原酸、阿魏酸等［5］。同時(shí)，應(yīng)用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化了平臥菊三七中綠原酸的提取工藝［6］。近年來(lái)，大孔樹(shù)脂被廣泛應(yīng)用于有機(jī)酸的提取工藝純化中。因此，本研究通過(guò)比較不同大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸附性能，篩選出分離純化平臥菊三七總有機(jī)酸的最優(yōu)樹(shù)脂，并對(duì)上樣質(zhì)量濃度、乙醇洗脫濃度、乙醇洗脫體積進(jìn)行優(yōu)化，為合理開(kāi)發(fā)利用平臥菊三七資源提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

平臥菊三七（江蘇省野生蔬菜研究所），大孔樹(shù)脂DM301（批號(hào)：2019-012），DM130（批號(hào)：2019-003），HPD100（批號(hào)：2019-005），HPD450（批號(hào)：2018-079），AB-8（批號(hào)：2018-090），均購(gòu)于鄭州勤實(shí)科技有限公司。一水合檸檬酸（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），鄰苯二甲酸氫鉀（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），NaOH固體顆粒（西隴科學(xué)股份有限公司）。KH-500B型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；THZ-82恒溫振蕩器（華藥企業(yè)），pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取物的制備

稱(chēng)取平臥菊三七藥材500 g，加入10倍量80%乙醇，80℃回流提取1 h，重復(fù)提取3次，抽濾，合并提取液。減壓濃縮至終體積為500 mL，以等體積石油醚萃取3次除雜，保鮮膜密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 NaOH溶液濃度的標(biāo)定

取100℃烘干至恒重的鄰苯二甲酸氫鉀0.418 0 g，酚酞為指示劑，滴定配制的NaOH溶液，平行測(cè)量3次，取平均值。測(cè)得NaOH溶液的準(zhǔn)確濃度為0.096 4 mol/L。

2.3 總有機(jī)酸的測(cè)定

參考朱晨晨等［7］方法，采用電位滴定法測(cè)定總有機(jī)酸。取平臥菊三七提取液或檸檬酸適量，加水溶解，定容，精密取，按電位滴定法，即將pH復(fù)合電極插入液面下，開(kāi)啟攪拌，確保滴定過(guò)程中待測(cè)溶液中濃度均勻，用上述標(biāo)定的NaOH滴定，測(cè)量有機(jī)酸的含量。采用Excel 2010版繪制一階導(dǎo)數(shù)曲線（ΔE/ΔV）-V。一階導(dǎo)數(shù)曲線最高點(diǎn)對(duì)應(yīng)的體積即為滴定終點(diǎn)體積，以檸檬酸計(jì)算總有機(jī)酸含有量。

2.4 檸檬酸消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH的量

稱(chēng)取檸檬酸0.135 0 g，用適量的蒸餾水溶解，充分吸收，已標(biāo)定的NaOH滴定檸檬酸溶液進(jìn)行測(cè)量。如圖1所示，曲線的極大值對(duì)應(yīng)體積就是滴定終點(diǎn)，消耗堿量為20.05 mL，即為滴定突躍點(diǎn)。計(jì)算為每消耗每1 mL NaOH滴定液（0.096 4 mol/L）相當(dāng)6.020 9 mg的檸檬酸。

圖1 檸檬酸對(duì)照品一階導(dǎo)數(shù)滴定曲線

2.5 平臥菊三七提取液中總有機(jī)酸測(cè)定

取平臥菊三七提取液1 mL，蒸餾水定容至50 mL，超聲溶解，用上述NaOH溶液滴定，結(jié)果如圖2所示。平臥菊三七粗提取液滴定至NaOH溶液消耗體積為1.75 mL時(shí)存在明顯的滴定突躍，即每1 mL的平臥菊三七提取液中含有相當(dāng)于10.536 6 mg的檸檬酸量。

圖2 平臥菊三七提取液中平臥菊三七提取液中總有機(jī)酸一階導(dǎo)數(shù)滴定曲線

3 酸純化工藝優(yōu)化

3.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理

取DM301，DM130，HPD100，HPD450，AB-8大孔樹(shù)脂200 g，用95%乙醇浸泡溶脹24 h，濕法裝柱，用2 BV的95%乙醇洗脫，以蒸餾水沖洗至無(wú)醇味，備用。

3.2 大孔樹(shù)脂的篩選

3.2.1 靜態(tài)吸附-解析性能考察實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取樹(shù)脂各5 g，置于50 mL錐形瓶中，加入平臥菊三七提取液5 mL，置于水浴振蕩器中振蕩2 h，待充分吸收后過(guò)濾，取蒸餾水洗滌大孔樹(shù)脂，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，再加入50%乙醇30 mL，置于水浴振蕩器中，充分振蕩，測(cè)定吸附率和解吸率進(jìn)行比較，公式為吸附量=（C0-V1）V1/m；解吸量=C2V2/m；吸附率=［（C0-C1）/C0］×100%；解吸率=解吸量/吸附量×100%（C0為總有機(jī)酸初始質(zhì)量濃度，C1為吸附平衡后總有機(jī)酸質(zhì)量濃度，C2為解吸后總有機(jī)酸質(zhì)量濃度，V1為吸附液體積，V2為解吸液體積，m為大孔樹(shù)脂質(zhì)量），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 5種大孔樹(shù)脂對(duì)平臥菊三七總有機(jī)酸靜態(tài)吸附的影響

結(jié)果顯示：HPD100，DM301，HPD100對(duì)有機(jī)酸都有較高的解析率，但HPD450在預(yù)處理階段顆粒大小不均一，容易分層，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定，故不采用；HPD 100和DM301的吸附量和解析量都比較高，做動(dòng)態(tài)吸附，進(jìn)一步篩選最優(yōu)樹(shù)脂。

3.2.2 動(dòng)態(tài)吸附-解析性能察實(shí)驗(yàn)

取5種類(lèi)型的樹(shù)脂10 g，裝入統(tǒng)一規(guī)格的色譜柱（2.0 cm×40 cm），量取5 mL樣品溶液，加蒸餾水30 mL進(jìn)行稀釋?zhuān)谜麴s水沖洗樹(shù)脂直至流出液基本無(wú)顏色，用NaOH溶液滴定液滴定，測(cè)定有機(jī)酸含量，如表2所示。

表2 5種大孔樹(shù)脂對(duì)平臥菊三七中總有機(jī)酸動(dòng)態(tài)吸附的影響

綜合結(jié)果顯示DM301對(duì)平臥菊三七提取液中的有機(jī)酸成分有較高的吸附率，HPD100靜態(tài)吸附雖然較高而且動(dòng)態(tài)比吸附量最高，但是比解析量較少，導(dǎo)致動(dòng)態(tài)的解析率只有48.34%，故采用DM301為最優(yōu)樹(shù)脂。

4 大孔樹(shù)脂對(duì)平臥菊三七總有機(jī)酸純化工藝研究

4.1 上樣質(zhì)量濃度對(duì)平臥菊三七提取液有機(jī)酸吸附量的影響

取DM301大孔樹(shù)脂3 g，置于50 mL錐形瓶中，分別量取3.32，5.07，7.18，7.61，8.51 mL的母液，然后加水定容至10 mL，配成3.5，5.34，7.57，8.02，8.97 mg/mL的總有機(jī)酸，放入水浴振蕩器中振搖2 h，待充分吸附后過(guò)濾，用上述NaOH溶液滴定，測(cè)定比吸附量，比較上樣濃度。

結(jié)果顯示，上樣質(zhì)量濃度在3.5～7.57 mg/mL時(shí)，吸附量隨著濃度的增加而增加，而達(dá)到7.57 mg/mL后吸附量隨著變化量的增加而逐漸減少，考慮到上樣液質(zhì)量濃度過(guò)高時(shí)易堵塞樹(shù)脂，所以上樣質(zhì)量濃度在7.57 mg/mL時(shí)為最佳上樣質(zhì)量濃度，如圖3所示。

圖3 上樣質(zhì)量濃度對(duì)平臥菊三七提取液有機(jī)酸吸附量的影響

4.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)平臥菊三七提取液中有機(jī)酸解吸附的影響

取DM301樹(shù)脂3 g，置于50 mL錐形瓶，加入5 mL質(zhì)量濃度為7.57 mg/mL總有機(jī)酸，加水定容到10 mL，放入水浴振蕩器中振搖2 h后，取出過(guò)濾，用蒸餾水沖洗樹(shù)脂直至流出液基本無(wú)顏色，再取30 mL體積分?jǐn)?shù)為50%，70%，90%，95%的乙醇沖洗樹(shù)脂，放于水浴振蕩器中，振搖2 h，充分吸附后取出過(guò)濾，測(cè)量溶液解析率，結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～90%時(shí)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)解析率達(dá)到最高，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)超過(guò)90%時(shí)，解析率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高而減少，所以當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)解析率最高。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)平臥菊三七提取液中有機(jī)酸解吸附的影響

4.3 乙醇體積對(duì)平臥菊三七提取液有機(jī)酸解吸附的影響

取DM301樹(shù)脂3 g，置于50 mL錐形瓶，加入5 mL濃度為7.57 mg/mL總有機(jī)酸，定容到10 mL，放入水浴振器中振搖2 h后，用蒸餾水沖洗樹(shù)脂直至流出液基本無(wú)顏色，再用2，4，6，8 BV的90%乙醇洗脫樹(shù)脂，放入水浴振蕩器中，振蕩2 h，等溶液充分吸收后，過(guò)濾得到濾液，測(cè)定解吸附量，比較解析率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 乙醇體積對(duì)平臥菊三七有機(jī)酸解吸附的影響

結(jié)果表明，2 BV的90%乙醇洗脫就可以將總有機(jī)酸洗脫下來(lái)，同時(shí)考慮到節(jié)約試劑，故選擇2 BV的90%乙醇為洗脫溶劑。

4.4 總有機(jī)酸純化工藝驗(yàn)證

取DM301樹(shù)脂3 g，置于50 mL錐形瓶，加入5 mL質(zhì)量濃度為7.57 mg/mL總有機(jī)酸，定容到10 mL，放入水浴振器中振搖2 h后，用蒸餾水沖洗樹(shù)脂直至流出液基本無(wú)顏色，再用2 BV的90%乙醇洗脫樹(shù)脂，放入水浴振蕩器中，振蕩2 h，等溶液充分吸收后，過(guò)濾得到濾液，用“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定濾液中總有機(jī)酸的濃度，測(cè)得結(jié)果為每1 mL的平臥菊三七提取液中含有相當(dāng)于15.054 3 mg的檸檬酸量，與初始提取液中總有機(jī)酸的含量（初始含量為每1 mL中含有相當(dāng)于10.536 6 mg的檸檬酸量）相比，提高了42.88%。

5 討論

有機(jī)酸是平臥菊三七的主要化學(xué)成分，其具有顯著的抗氧化作用。因此，分離純化平臥菊三七總有機(jī)酸對(duì)研究其藥理作用具有重要的意義。

根據(jù)有機(jī)酸結(jié)構(gòu)及性質(zhì)的差異，常采用的分離純化方法有酸堿法、離子交換樹(shù)脂法、大孔樹(shù)脂吸附法、活性炭吸附法等［8-9］。大孔樹(shù)脂是一類(lèi)不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的高聚物吸附劑，具有價(jià)格便宜、選擇性好、操作簡(jiǎn)單、適用于范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，在很多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用，但還未應(yīng)用到平臥菊三七總有機(jī)酸的研究。因此，本實(shí)驗(yàn)可為平臥菊三七中總有機(jī)酸成分的純化工藝提供理論依據(jù)。