發(fā)酵工藝條件對(duì)黑曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶的影響

雷嬌，宋宏新，李鵬娟，薛海燕，肖瑜，徐丹，*

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021；2.寶雞市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西寶雞721013）

發(fā)酵工藝條件對(duì)黑曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶的影響

雷嬌1，宋宏新1，李鵬娟1，薛海燕1，肖瑜2，徐丹1，*

（1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安710021；2.寶雞市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，陜西寶雞721013）

為研究黑曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素B1（AFB1）降解酶的影響因素，試驗(yàn)以AFB1降解率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察不同培養(yǎng)基成分和不同發(fā)酵條件對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響。結(jié)果顯示，碳源、氮源、金屬離子、AFB1類似物等對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)影響不大，但對(duì)降解酶合成有顯著影響，且該酶是一種誘導(dǎo)酶；發(fā)酵溫度、時(shí)間、初始pH等對(duì)降解酶合成也有顯著影響，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)AFB1降解率達(dá)87.5%，初始pH為7.0時(shí)AFB1降解率達(dá)89.3%，發(fā)酵時(shí)間與AFB1降解率呈正相關(guān)性，培養(yǎng)4 d時(shí)降解率達(dá)83.5%。研究結(jié)果可為AFB1降解酶的發(fā)酵工藝條件優(yōu)化及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。

黑曲霉；黃曲霉毒素B1；降解；發(fā)酵工藝

黃曲霉毒素B1（AFB1）是由黃曲霉產(chǎn)生的具有強(qiáng)致癌性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，1993年被世界衛(wèi)生組織（WHO）定為Ι類致癌物[1-3]。其在糧食作物中的污染最為嚴(yán)重，2011年～2012年，由于奶牛飼料被AFB1污染，使得我國(guó)蒙牛、南山等乳制品中AFM1超標(biāo)，不僅危害公眾健康，同時(shí)給企業(yè)及社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為影響社會(huì)穩(wěn)定的食品安全事件。因此，控制食品中真菌毒素的污染成為一個(gè)亟待解決問題。

傳統(tǒng)的物理和化學(xué)方法在一定程度上能降低AFB1的污染[4-6]，但通常這兩種方法都存在去毒不完全、易降低食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、應(yīng)用性差等缺點(diǎn)[7-8]。因此，尋找一種安全、高效脫除AFB1的方法就顯得尤為重要，而微生物降解AFB1具備上述優(yōu)勢(shì)，其代表了真菌毒素防治的新方向[9-10]。Alberts[11-12]發(fā)現(xiàn)紅串紅球菌發(fā)酵液對(duì)AFB1有降解效果，孵育48h后，降解率達(dá)83%，且與AFB1相比，降解產(chǎn)物的致突變性明顯減弱；Guan[13]研究發(fā)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶K、SDS和加熱處理后，降解效果明顯下降，其最適酶解溫度為37℃、pH為8，且Mg2+、Cu2+對(duì)AFB1降解有激活作用，Zn2+則有抑制作用。

國(guó)內(nèi)學(xué)者李冰等[14]從黑曲霉中提取了對(duì)AFB1有降解效果的胞外粗提液，其降解率達(dá)93.28%；本試驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)從醬醅中分離出的黑曲霉具有降解AFB1的作用，且該作用屬于胞外酶的酶促降解，為探究發(fā)酵條件對(duì)黑曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素B1降解酶的影響，本試驗(yàn)在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上以AFB1降解率及菌體干重作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響，為后期大規(guī)模發(fā)酵試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

黑曲霉（Aspergillusniger），分離于醬醅中，PDA培養(yǎng)基4℃保存。

1.1.2培養(yǎng)基

馬鈴薯固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，自然pH，121℃高壓滅菌20min。

馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、自然pH、121℃高壓滅菌20min。

1.1.3試劑

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）：Fisher公司；三氯甲烷（分析純）、正己烷（分析純）、三氟乙酸（化學(xué)純）：阿拉丁試劑有限公司。

1.1.4儀器與設(shè)備

SW-CJ-1D型潔凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；MJ-180B型霉菌培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；Agilent1200高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫公司；LDZM-40KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-F160恒溫震蕩培養(yǎng)箱：常州諾基儀器有限公司；MD 200氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1黑曲霉孢子懸浮液的制備

將黑曲霉菌種接種于PDA斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)7 d，用生理鹽水洗脫并收集孢子，調(diào)整濃度為105CFU/mL，備用。

1.2.2培養(yǎng)基成分對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響

1.2.2.1碳源

將PDB中葡萄糖分別用蔗糖、麥芽糖，乳糖代替，添加量為2%，向含有不同碳源的培養(yǎng)基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養(yǎng)基為50mL，接種量為2%），30℃、150 r/min培養(yǎng)72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測(cè)定菌體干重及AFB1的降解率，分析碳源對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響。

1.2.2.2氮源

向PDB中分別添加硝酸鈉、氯化銨、酵母膏和蛋白胨，添加量為0.2%，并向含有不同氮源的培養(yǎng)基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養(yǎng)基為50 mL，接種量為2%），30℃、150 r/min培養(yǎng)72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測(cè)定菌體干重及AFB1的降解率，分析氮源對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響。

1.2.2.3金屬離子

向PDB中分別添加Fe3+，Ca2+，Mn2+，Zn2+，添加量為5mmol/L，并向含有不同金屬離子的培養(yǎng)基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養(yǎng)基為50mL，接種量為2%），30℃、150 r/min培養(yǎng)72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測(cè)定菌體干重及AFB1的降解率，分析金屬離子對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響。

1.2.2.4結(jié)構(gòu)類似物

向PDB中分別添加香豆酸和香豆素，添加量為0.05%，并向含有不同結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養(yǎng)基為50mL，接種量為2%），30℃、150 r/min培養(yǎng)72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測(cè)定菌體干重及AFB1的降解率，分析結(jié)構(gòu)類似物對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響。

1.2.3發(fā)酵條件對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響

1.2.3.1溫度

將黑曲霉孢子懸浮液接種于50mLPDB（接種量為2%），分別于20、25、30、35、40℃，150 r/min培養(yǎng)72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測(cè)定菌體干重及AFB1的降解率，分析溫度對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響。

1.2.3.2 pH值

調(diào)節(jié)PDB初始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，并向不同初始pH的培養(yǎng)基中接種黑曲霉孢子懸浮液（培養(yǎng)基為50mL，接種量為2%），30℃，150 r/min培養(yǎng)72 h后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測(cè)定菌體干重及AFB1的降解率，分析pH對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響。

1.2.3.3培養(yǎng)時(shí)間

將黑曲霉孢子懸浮液接種于50mLPDB（接種量為2%），30℃，150 r/min，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d后過濾，收集濾液和菌絲體，分別測(cè)定菌體干重及AFB1的降解率，分析發(fā)酵時(shí)間對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響。

1.2.4測(cè)定方法

菌體干重測(cè)定先用紗布過濾菌絲體，用無菌水將收集到的菌絲體沖洗兩次，80℃下烘干至恒重。降解率的測(cè)定采用柱前衍生HPLC-FLD檢測(cè)方法測(cè)定樣品中毒素的含量，計(jì)算降解率。

2結(jié)果與討論

2.1培養(yǎng)基成分對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響

2.1.1碳源

菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的積累均需要一定的碳源，尤其是以產(chǎn)酶為目的的發(fā)酵過程中，一些碳源物質(zhì)成分對(duì)促進(jìn)產(chǎn)酶有重要的影響。碳源對(duì)菌體干重的影響如圖1所示，碳源對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響如圖2所示。

圖1 碳源對(duì)菌體干重的影響Fig.1 Effectofcarbon sourceson thedryweightof Aspergillusniger

圖2 碳源對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響Fig.2 Effectof carbon sourceson degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

由圖1、圖2可知不同碳源對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)無顯著影響（P＞0.05），但對(duì)AFB1降解酶的合成影響顯著（P＜0.05），其中添加蔗糖的效果最好，毒素降解率達(dá)91.5%，可能因?yàn)楹谇狗置诘摩?呋喃果糖苷酶能分解蔗糖產(chǎn)生葡萄糖和果糖，而果糖更容易被黑曲霉利用產(chǎn)酶[15]。

2.1.2氮源

氮源是微生物細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其功能是為生物細(xì)胞合成含氮代謝產(chǎn)物，也是構(gòu)成酶的主要成分[16]。氮源對(duì)菌體干重的影響如圖3所示，氮源對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響如圖4所示。

由圖3～圖4所示，只有酵母膏能促進(jìn)黑曲霉生長(zhǎng)，而當(dāng)額外添加氮源時(shí)能將AFB1降解率從61%提高到73.5%，黑曲霉對(duì)氯化銨和酵母膏的利用率較高，且酵母膏中含有的必需氨基酸及B族維生素、核苷酸、微量元素等促進(jìn)了黑曲霉的新陳代謝和產(chǎn)酶，使得它比其他氮源表現(xiàn)出更好的促進(jìn)效果。

圖3 氮源對(duì)菌體干重的影響Fig.3 Effectof nitrogen sourceon the dryweightof Aspergillus niger

圖4 氮源對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響Fig.4 Effectofnitrogen sourceson degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

2.1.3金屬離子

金屬離子對(duì)菌體干重的影響如圖5所示，金屬離子對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響如圖6所示。

圖5 金屬離子對(duì)菌體干重的影響Fig.5 Effectofmetal ionson the dryweightof Aspergillusniger

圖6 金屬離子對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響Fig.6 Effectofmetal ionson degradation enzym eof AFB1produced by Aspergillusniger

如圖5～圖6所示，F(xiàn)e3+能顯著抑制黑曲霉生長(zhǎng)，進(jìn)而降低AFB1降解酶的產(chǎn)量，孫啟紅[17]等研究發(fā)現(xiàn)高濃度Fe3+對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，推測(cè)Fe3+對(duì)細(xì)菌的抑制作用是通過Fe3+催化羥自由基的形成抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；Zn2+、Ca2+、Mn2+對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)影響不大，但Zn2+、Ca2+對(duì)降解酶合成有明顯促進(jìn)作用，將AFB1降解率分別提高至76%、93%，可能由于Zn2+、Ca2+與AFB1降解酶結(jié)合，從而提高了酶活。

2.1.4結(jié)構(gòu)類似物

結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌體干重的影響如圖7所示，結(jié)構(gòu)類似物對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響如圖8所示。

圖7 結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌體干重的影響Fig.7 Effectof AFB1analogueson thed ry weightof Aspergillusniger

如圖7～圖8所示，香豆素和香豆酸對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)的促進(jìn)作用較小，但能顯著增強(qiáng)降解酶的合成，尤其添加香豆酸的黑曲霉發(fā)酵液降解效果好，降解率達(dá)到89.5%，說明該降解酶很可能是一種誘導(dǎo)酶，AFB1的結(jié)構(gòu)類似物作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)酶的合成。

圖8 結(jié)構(gòu)類似物對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響Fig.8 Effectof AFB1analogueson degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

2.2發(fā)酵條件對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響

2.2.1發(fā)酵溫度

溫度對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響如圖9所示。

圖9 溫度對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響Fig.9 Effectof tem peratureon degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

如圖9所示，在20℃～30℃之間，溫度的增加有助于黑曲霉對(duì)AFB1的降解，在30℃時(shí)毒素降解率達(dá)到最大值87.5%，當(dāng)溫度大于40℃后，黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的能力明顯下降，這說明溫度對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)有較大的影響，黑曲霉所產(chǎn)酶系的最適溫度一般都在30℃左右，如黑曲霉液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶時(shí)，當(dāng)發(fā)酵溫度控制在30℃時(shí)酶活達(dá)到最大值[18]。

2.2.2初始pH值

初始pH對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響如圖10所示。

如圖10所示，pH在4～7之間時(shí)，黑曲霉對(duì)AFB1的降解率逐漸增加，在pH 7.0時(shí)降解率達(dá)到最高值89.3%，當(dāng)pH大于7后，降解效果逐漸減弱，說明pH值在4～7時(shí)有利于黑曲霉生長(zhǎng)產(chǎn)酶，從而促進(jìn)了對(duì)AFB1的降解作用。

圖10 初始pH對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響Fig.10 Effectof initialpH on degradation enzym eof AFB1produced by Aspergillusniger

2.2.3培養(yǎng)時(shí)間

時(shí)間對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響如圖11所示。

圖11 時(shí)間對(duì)黑曲霉產(chǎn)AFB1降解酶的影響Fig.11 Effectof tim eon degradation enzymeof AFB1produced by Aspergillusniger

如圖11所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)黑曲霉發(fā)酵液降解毒素的能力逐漸增強(qiáng)，在培養(yǎng)第3天到第4天時(shí)黑曲霉降解率有顯著增加，從57%增加到83.5%，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，黑曲霉解毒酶對(duì)AFB1的降解率趨于穩(wěn)定，說明培養(yǎng)到第6天時(shí)黑曲霉所產(chǎn)AFB1降解酶達(dá)到穩(wěn)定。

3結(jié)論

碳源、氮源、金屬離子、AFB1類似物等對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)影響不大，但對(duì)降解酶合成有顯著影響，且該酶是一種誘導(dǎo)酶；發(fā)酵溫度、時(shí)間、初始pH等對(duì)降解酶合成也有顯著影響。而微生物在發(fā)酵過程中受到的影響因素眾多，代謝產(chǎn)物的調(diào)控及其復(fù)雜，為進(jìn)一步優(yōu)化AFB1降解酶的發(fā)酵工藝條件，提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，還要考慮各因素之間的交叉影響，并利用數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)和優(yōu)化各影響因素，指導(dǎo)工業(yè)化大生產(chǎn)。

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Effects of Fermentation Conditions on the Production of A flatoxin B1Degradation Enzyme from Aspergillus niger

LEIJiao1，SONGHong-xin1，LIPeng-juan1，XUEHai-yan1，XIAOYu2，XUDan1，*
（1.Schoolof Food and BiologicalEngineering，ShaanxiUniversity ofScienceand Technology，Xi'an 710021，Shaanxi，China；2.BaojiTesting Centerof Food and Drug Inspection，Baoji721013，Shaanxi，China）

To study the effectof different factors on the production of aflatoxin B1（AFB1）degradation enzyme from Aspergillus niger.Experiment with AFB1degradation rate as the evaluation index，inspected different culturemedium and different fermentation conditions.The results showed that the carbon and nitrogen sources，metal ionsand AFB1analogshad little effecton the growth of Aspergillusniger，buthad significanteffecton the synthesisofdegradation enzyme，and the enzymewasan inducible enzyme.Furthermore，fermentation temperature，time and initial pH had significanteffects on the degradation ofenzyme synthesis.When the temperature（30℃）and the initial pH 7，the degradation rate of AFB1reached 87.5%and 89.3%，respectively.The re－search also found that fermentation time and the degradation rate of AFB1waspositively correlated.On the days 4，degradation rate of AFB1was83.5%.The research results can provide theoreticalguidance for the optimization of fermentation conditionsand industrialproduction of AFB1degradingenzyme.

Aspergillusniger；aflatoxin B1；degradation；fermentation condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.041

2016-12-09

陜西省科技廳自然基金項(xiàng)目（2013JQ3019）；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目（2015NY002）

雷嬌（1991—），女（漢），在讀研究生，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制。

*通信作者：徐丹（1981—），女，講師，博士，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。