多重PCR技術(shù)在快速檢測食源性致病菌中的研究進展

于世成

摘 要：食品性致病菌是影響食品安全的重要因素之一，傳統(tǒng)微生物檢驗方法檢驗周期較長、培養(yǎng)鑒定繁瑣復(fù)雜，已越來越難以滿足現(xiàn)代社會食品安全快速檢測的需要，因而更加快速簡便高效的檢測方法成為科研熱點。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)由于具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本低等優(yōu)點，越來越多的被應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。

關(guān)鍵詞：食品性致病菌;多重PCR 快速;特異性強;靈敏度高

目前，已有報道的食源性致病菌接近300種，其中金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、沙門氏菌、單核細胞性李斯特菌等都是最常見的，由其引發(fā)的食源性疾病對人類健康造成了極大的危害，是食品安全重大隱患。隨著食品安全事故的頻繁發(fā)生，人民對食品安全的關(guān)注程度越來越高。食品微生物檢驗作為食品安全檢測的一項重要的技術(shù)手段，可為保障食品安全提供強有力的科學(xué)依據(jù)。當(dāng)今社會飛速發(fā)展，傳統(tǒng)微生物檢驗方法檢驗周期較長、培養(yǎng)鑒定繁瑣復(fù)雜，已越來越難以滿足現(xiàn)代社會食品安全快速檢測的需要，因而更加快速簡便高效的檢測方法成為科研熱點。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測領(lǐng)域。

1 PCR技術(shù)發(fā)展概況

PCR即聚合酶鏈式反應(yīng)，簡單來說就是一種使DNA在短時間內(nèi)呈指數(shù)增加的分子技術(shù)。PCR是通過控制不同溫度實現(xiàn)DNA變性-退火-延伸這一過程的連續(xù)多次循環(huán)，每循環(huán)一次（約2～4 min）DNA擴增一次，3 h就可以將特定DNA倍增成百上千萬倍。經(jīng)過30多年的發(fā)展，PCR技術(shù)已有十幾種之多，例如QPCR、多重PCR、微滴式數(shù)字PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR等，目前被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、考古等領(lǐng)域。在食品安全檢測領(lǐng)域，PCR技術(shù)主要應(yīng)用于微生物、轉(zhuǎn)基因食品的檢測、動物源性成分檢測等方面。

2 多重PCR技術(shù)

多重PCR的基本原理、反應(yīng)試劑和操作過程與常規(guī)PCR相同，不同之處在于可以在同一PCR反應(yīng)體系中同時加入多種特異性引物從而實現(xiàn)多種目的DNA的同時擴增，在保留傳統(tǒng)PCR檢測質(zhì)量優(yōu)勢的同時顯著減少檢測步驟，具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟簡便性等特點，目前在食品中多種微生物的同時檢測中得到廣泛應(yīng)用。

3 研究應(yīng)用進展

3.1 在果蔬檢測中的應(yīng)用

大連理工大學(xué)博士馮可[1]根據(jù)鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7和單核增生性李斯特菌4種致病菌菌的靶基因設(shè)計特異性探針，建立了同時檢測鮮切果蔬中這4種致病菌的多重實時熒光PCR檢測方法，對應(yīng)的檢出限分別為4.2×104、1.8×104、7.3×104 CFU/mL和5.4×104 CFU/mL。

3.2 在肉及肉制品檢測中的應(yīng)用

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院潘彤媛等[2]分別選擇沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7和小腸耶爾森氏菌基因組中高特異性的inv A基因、ECs3032和ail基因，設(shè)計并篩選具有高特異性的引物，建立了雞肉中沙門氏菌、大腸桿菌O157：H73和小腸耶爾森氏菌種致病菌的多重PCR檢測方法，同時檢測3種菌的靈敏度為103 CFU/mL，單菌培養(yǎng)物檢測靈敏度均為101 CFU/mL。

3.3 在乳及乳制品檢測中的應(yīng)用

徐州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院姜華等[3]利用篩選出的3對特異性較高的引物建立了一種同時檢測嬰幼兒配方奶粉中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和克羅諾桿菌3種食源性致病菌的多重PCR檢測方法，其檢出限達到

103 CFU/g。內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院杜琳等[4]采用細菌基因組提取試劑盒提取生鮮乳中的布魯氏桿菌基因組DNA，針對布魯氏桿菌保守抗原Omp25、Omp31設(shè)計引物，并設(shè)計細菌16S rDNA基因序列作為內(nèi)參引物，建立了生鮮乳中布魯氏桿菌的多重PCR檢測方法，能夠擴增出布魯氏桿菌Omp25

（140 bp）、Omp31（472 bp）特異性片段以及細菌16S rDNA的通用片段，靈敏度可達1×105 CFU/mL。上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院苗小草等[5]采用針對金黃色葡萄球菌nuc基因、克羅諾桿菌屬gyr B基因、沙門氏菌omp C基因和單核細胞增生李斯特菌hly基因設(shè)計特異性引物，建立了同時快速檢測乳品中檢出率較高的這4種食源性致病菌的四重PCR方法，可同時檢出初始菌濃度為1 CFU/mL的4種乳品致病菌。

3.4 在其他食品檢測中的應(yīng)用

大連工業(yè)大學(xué)晚觀生等[6]以基因wzx O111、rfb EO157為靶基因，建立了快速檢測食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O111和O157的多重PCR結(jié)合變性高效液相色譜技術(shù)，可以一次PCR擴增同時檢測大腸桿菌O111、O157，靈敏度達到25 CFU/mL。

隨著科技水平和生物技術(shù)的進一步發(fā)展，多重PCR技術(shù)在食品微生物快速檢測中的應(yīng)用已成為一種趨勢。然而，在看到多重PCR技術(shù)諸多優(yōu)點的同時，也要清醒的認識到其存在的多對引物間干擾、易受抑制因子感染、擴增效率一致性不高等缺點。但相信今后更多簡便快速、靈敏準確的食品微生物多重PCR檢測技術(shù)方法將會出現(xiàn)，并得到更加廣泛的應(yīng)用推廣，為及時判定和有效預(yù)防食品安全事故的發(fā)生提供更加準確有效的方法與技術(shù)依據(jù)，這對于確保社會食品安全具有深遠的現(xiàn)實意義。

參考文獻

[1]馮可.鮮切果蔬食源性病原微生物快速檢測技術(shù)的研究[D].大連：大連理工大學(xué)，2017.

[2]潘彤媛，張偉.三重PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)）檢測雞肉中常見病原菌的研究[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（14）：140-143.

[3]姜華，焦陽，李遠宏，等.多重PCR檢測嬰幼兒配方奶粉中3種食源性致病菌[J].食品工業(yè)科技2018，39（14）.

[4]杜琳，王麗芳，姚一萍，等.生鮮乳中布魯氏桿菌多重PCR檢測方法的建立[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（9）：211-213，218.

[5]苗小草，陳萬義，施春雷，等.乳品中4種常見致病菌多重PCR檢測方法的建立[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2018（1）：63-71.

[6]晚觀生，劉曉玉，鄭秋月，等.多重PCR-DHPLC快速檢測食品中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌[J].工業(yè)微生物，2016（3）：46.