清旨寧膠囊中沙棘成分薄層色譜鑒別方法

鄧辰辰，許明君，相繼芬, ，王婧，丁艷，柏偉榮

1. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司（連云港 222047）；2. 中藥提取精制新技術(shù)重點(diǎn)研究室（連云港 222047）

清旨寧膠囊是一種主要以沙棘、肉蓯蓉、丹參、紅曲等為原料制成的保健食品，具有降血脂的功效。主要制劑工藝為：將沙棘、肉蓯蓉、丹參按配方比例稱其質(zhì)量，加入適量水，煎煮合并濾液，濃縮，噴霧干燥，制粒，加入紅曲總混，添加輔料后灌裝成膠囊或壓片包衣。為了保證制劑的品質(zhì)，建立品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)對(duì)其中的主要成分沙棘進(jìn)行薄層色譜鑒別。

薄層層析技術(shù)是發(fā)展較早的色譜方法之一，其基本原理是利用混合物各組分在某一物質(zhì)中的吸附或者分配等性能的不同，使樣品溶液中各種物質(zhì)進(jìn)行反復(fù)的吸附或者分配等作用，從而將各種組分分開(kāi)。研究[1-5]中，對(duì)沙棘成分的TLC鑒別均參考藥典[6]方法，鑒別其中的黃酮類成分。藥典方法前處理復(fù)雜，需自制含3%醋酸鈉的硅膠G板且存在陰性干擾。研究建立的鑒別方法快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，為含有沙棘、肉蓯蓉、丹參、紅曲等成分的產(chǎn)品研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器與設(shè)備

ZF-20D型暗箱三用紫外分析儀（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA 224S-CW型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；BP 211D型電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；HPD 260型恒溫恒濕箱（德國(guó)美墨爾特有限公司）；DHG-9145A型熱風(fēng)循環(huán)烘箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 對(duì)照藥材與對(duì)照品

沙棘對(duì)照藥材（批號(hào)121519-200501，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；異鼠李素對(duì)照品（純度99.9%，批號(hào)110860-201410，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；槲皮素對(duì)照品（純度99.1%，批號(hào)100081-201610，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；齊墩果酸對(duì)照品（純度91.7%，批號(hào)110709-201607，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

1.2 試劑與材料

硅膠G薄層層析板（青島海洋化工有限公司、青島勝海精細(xì)硅膠化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青島裕民源硅膠試劑廠）；薄層層析硅膠G（青島海洋化工有限公司）；其余試劑為分析純（南京化學(xué)試劑股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)樣品

清旨寧膠囊（批號(hào)20171201、20171202、20171203）共3批次，為江蘇康緣現(xiàn)代中藥研究院研制。

2 方法與結(jié)果

2.1 參照藥典方法鑒別沙棘

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

取異鼠李素和槲皮素對(duì)照品，加甲醇制成濃度1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 對(duì)照藥材溶液制備

精確稱取0.5 g沙棘對(duì)照藥材粉末，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 95%乙醇，稱其質(zhì)量，加熱回流提取1 h后，冷卻至室溫，稱其質(zhì)量，用95%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻后過(guò)濾。吸取25 mL續(xù)濾液，置具塞錐形瓶中，加入3.5 mL鹽酸，于75 ℃水浴中加熱水解1 h，立刻冷卻，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用95%乙醇少量多次洗滌錐形瓶，洗液并入同一容量瓶中，定容，搖勻后過(guò)濾。吸取30 mL續(xù)濾液，濃縮至約5 mL，加25 mL水，于分液漏斗中用乙酸乙酯提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，加入1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，作為?duì)照藥材溶液[6]。

2.1.3 供試品溶液制備

取2 g膠囊內(nèi)容物粉末，按照上述對(duì)照藥材處理方法，制備供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液制備

取除沙棘以外的其他處方藥味，按處方比例及制劑工藝制備陰性制劑，按供試品溶液制備方法，制備陰性樣品溶液。

2.1.5 薄層色譜鑒別

吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一含3%醋酸鈉溶液制備的硅膠G薄層板（自制）上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈（365 nm）下檢視[6]。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 藥典方法沙棘TLC圖

由圖1可以看出，陰性有干擾，藥典方法不適合該產(chǎn)品中沙棘的TLC鑒別。取四味原料藥材分別按制劑工藝制備單味藥材制劑，按上述方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，各單味藥材制劑與對(duì)照品溶液相同位置處均有熒光斑點(diǎn)。分析結(jié)果，應(yīng)該是其他藥材中的黃酮類成分大部分以異鼠李素、槲皮素、山柰酚為母核，含氧雜環(huán)化合物與三氯化鋁試液反應(yīng)顯色，從而干擾沙棘的鑒別，導(dǎo)致假陽(yáng)性。

圖2 單味藥材制劑TLC圖

2.2 自建方法鑒別沙棘

2.2.1 對(duì)照品溶液制備

取齊墩果酸對(duì)照品，用甲醇溶解，制成1 mg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液制備

稱取0.5 g沙棘對(duì)照藥材粉末約，加入20 mL三氯甲烷，超聲處理30 min，過(guò)濾后蒸干，加1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，離心后取上清液作為對(duì)照藥材溶液。

2.2.3 供試品溶液制備

取2 g膠囊內(nèi)容物粉末，對(duì)照藥材處理方法，制備供試品溶液。

2.2.4 陰性樣品溶液制備

取除沙棘以外的其他處方藥味，按處方比例和制劑工藝制備陰性制劑，按供試品溶液制備方法，制備陰性樣品溶液。

2.2.5 薄層色譜鑒別

吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、陰性樣品溶液各4 μL，供試品溶液各1，2和4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見(jiàn)圖3。

供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。色譜斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，Rf值合適，分離度較好，無(wú)陰性干擾。樣品和對(duì)照品的點(diǎn)樣量在4 μL時(shí)分離效果好，斑點(diǎn)清晰。故采用該方法進(jìn)行沙棘薄層鑒別方法學(xué)考察，專屬性較好。

2.3 耐用性考察

2.3.1 展開(kāi)劑考察

考察3種展開(kāi)系統(tǒng)：A，三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）；B，二氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）；C，三氯甲烷-乙醇-甲酸（40∶1∶1）；點(diǎn)樣量4 μL。結(jié)果見(jiàn)圖4。

可以看出，選擇展開(kāi)系統(tǒng)A時(shí)，斑點(diǎn)清晰可見(jiàn)，分離度較好，故確定三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）為TLC鑒別條件。

圖3 自建方法沙棘TLC圖

圖4 沙棘TLC展開(kāi)系統(tǒng)考察

2.3.2 不同薄層板考察

選擇不同廠家薄層板（青島海洋化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青島裕民源硅膠試劑廠），點(diǎn)樣量4 μL，按照2.1.5的方法展開(kāi)，顯色。結(jié)果見(jiàn)圖5。3種硅膠G板都可以達(dá)到較好分離效果，且斑點(diǎn)清晰。說(shuō)明方法對(duì)不同廠家薄層板耐用性較好。

圖5 沙棘TLC薄層板考察

2.3.3 溫度的考察

采用同一廠家的薄層板（青島海洋化工廠分廠），考察不同溫度（低溫4 ℃和室溫20 ℃）條件對(duì)薄層鑒別的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。

可以看出，在不同溫度4 ℃和20 ℃下，對(duì)照品溶液與供試品溶液薄層色譜圖斑點(diǎn)無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，分離度較好，但溫度過(guò)低時(shí)供試品斑點(diǎn)較模糊。相比較而言，20 ℃時(shí)分離效果較好，說(shuō)明薄層鑒別方法的溫度耐用性良好。

圖6 沙棘薄層鑒別溫度考察

2.3.4 濕度的考察

采用同一廠家的薄層板（青島海洋化工廠分廠），在一小房間中用除濕機(jī)和加濕器控制環(huán)境濕度，考察不同濕度（40%，60%和80%）條件對(duì)薄層鑒別的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。

從圖7可知，在3種不同相對(duì)濕度（40%，60%和80%）的條件下展開(kāi)，對(duì)照品、對(duì)照藥材溶液和供試品溶液的TLC斑點(diǎn)均能實(shí)現(xiàn)分離，分離度較好；但相對(duì)濕度過(guò)高時(shí)，斑點(diǎn)拖尾較明顯，說(shuō)明薄層鑒別方法的濕度耐用性良好。

圖7 沙棘薄層鑒別濕度考察

2.4 3批次制劑中沙棘TLC鑒別

圖8 3批次制劑中沙棘薄層鑒別驗(yàn)證

取3批次制劑成品，研細(xì)混勻，分別取2 g粉末，加20 mL三氯甲烷，超聲處理30 min，過(guò)濾后蒸干，加1 mL甲醇溶解殘?jiān)?，離心后取上清液作為供試品溶液。吸取對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，結(jié)果見(jiàn)圖8。結(jié)果顯示，供試品溶液薄層色譜圖中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液薄層色譜的相應(yīng)位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，Rf值合適，分離度較好。

3 討論

采用藥典方法對(duì)該制劑中的沙棘進(jìn)行TLC鑒別時(shí)，前處理方法復(fù)雜，需要自制3%醋酸鈉硅膠G板，且陰性有干擾，主要是其他各味藥材中的含氧雜環(huán)化合物導(dǎo)致假陽(yáng)性。查閱文獻(xiàn)[7-12]后，選擇齊墩果酸作為配方中沙棘特有的標(biāo)志性成分，采用自建方法進(jìn)行TLC鑒別。

在供試品溶液的制備中，考察不同溶劑（乙酸乙酯、三氯甲烷、95%乙醇）超聲提取方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三氯甲烷超聲提取法對(duì)沙棘中熊果酸提取效率最高，分離度好且無(wú)陰性干擾，可直接進(jìn)行點(diǎn)樣，避免復(fù)雜的前處理步驟。

展開(kāi)系統(tǒng)的選擇上，比較3種展開(kāi)系統(tǒng)，確定三氯甲烷-甲醇-甲酸（40∶1∶1）為展開(kāi)條件時(shí)，色譜斑點(diǎn)清晰、分離度好。系統(tǒng)耐用性試驗(yàn)表明，該自建方法對(duì)溫度、濕度、不同廠家薄層板的耐用性較好。

4 結(jié)論

薄層色譜法是中藥復(fù)方制劑定性鑒別的主要方法，具有專屬性強(qiáng)、簡(jiǎn)便易操作等特點(diǎn)。試驗(yàn)利用齊墩果酸對(duì)清旨寧復(fù)方制劑中的沙棘進(jìn)行薄層色譜的研究和分析，所建立的TLC鑒別方法快速、準(zhǔn)確、可靠、耐用性強(qiáng)，可對(duì)清旨寧復(fù)方制劑進(jìn)行科學(xué)的品質(zhì)控制，為同樣含有類似原料成分的產(chǎn)品品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

后續(xù)研究可以考察并確定按藥典方法鑒別時(shí)產(chǎn)生干擾的黃酮類成分的分子結(jié)構(gòu)。