QuEChERS凈化法快速檢測食品中的脫氫乙酸

黃珊，范云燕，孫琦，蘇穎

南寧市疾病預(yù)防控制中心（南寧 530023）

脫氫乙酸是聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)使用的一種食品防腐劑，在中國被廣泛用于黃油、腌制蔬菜、發(fā)酵豆制品、面包、糕點、復(fù)合調(diào)味料、熟肉制品等食品的防腐，使用范圍和添加量都有嚴(yán)格的規(guī)定[1]。但是在食品生產(chǎn)加工過程中違規(guī)、超標(biāo)使用脫氫乙酸作防腐劑的現(xiàn)象時有發(fā)生，特別是一些小工廠小作坊違規(guī)使用食品添加劑的現(xiàn)象尤為嚴(yán)重，帶來嚴(yán)重食品安全隱患。因此快速高效經(jīng)濟地檢測食品中的脫氫乙酸對食品安全風(fēng)險監(jiān)測工作有重要意義。

國家標(biāo)準(zhǔn)中高效液相色譜法是脫氫乙酸檢測的常用方法[2-3]。由于樣品含有的色素、蛋白質(zhì)、脂肪及淀粉等基質(zhì)，對樣品的前處理及色譜分析過程有很大影響，因此GB 5009.121—2016中液相色譜法在不同類型的樣品提取過程中使用SPE柱進(jìn)行樣品的凈化，以達(dá)到除雜質(zhì)的目的，凈化的過程工作量大、效率低，且SPE凈化柱價格貴。凈化后的樣品用高效液相色譜進(jìn)行分析時，由于脫氫乙酸與C18柱中的硅醇基作用，色譜峰易拖尾，不利于定量分析。國內(nèi)外研究對于樣品前處理方法較多的是對蛋白沉淀劑的選擇進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化[4-5]，或者前處理過程不凈化過濾膜后直接用超高效液相色譜分析[6-8]，也有報道使用蒸餾法提取脫氫乙酸[9]，這些方法要么不能充分除去樣品中雜質(zhì)，要么提取過程復(fù)雜耗時長，因此開發(fā)一種簡單方便的提取凈化方法十分必要。對于色譜峰拖尾現(xiàn)象，文獻(xiàn)中較多的是使用封端工藝的C18柱解決峰拖尾問題[10-11]，因此摸索一種使用普通C18柱分析檢測脫氫乙酸的色譜條件有利于方法的推廣與實際應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純，德國Meker公司）；PSA（N-丙基乙二胺）、C18與GCB（石墨化碳黑）粉末（均為安捷倫公司）；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.9%，壇墨質(zhì)檢）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100液相色譜儀（配有DAD檢測器）；3K15冷凍離心機（美國Sigma公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（2.1 mm×250 mm，5.0 μm）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測波長293 nm。

1.3.2 流動相優(yōu)化

以甲醇+0.02 mol/L的乙酸銨（5∶95）為流動相，用氨水調(diào)節(jié)流動相的pH 8.0。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.100 0 g脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中，以水定容至刻度，此溶液為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，質(zhì)量濃度1 000 mg/L。吸取10.00 mL脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用水定容至100 mL，質(zhì)量濃度100 mg/L。分別吸取0.50，1.00，3.00，5.00，8.00，10.00和20.0 mL 100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL容量瓶，用純水定容至刻度，配制成2.00，4.00，12.0，20.0，32.0，40.0和80.0 mg/L系列質(zhì)量濃度。

1.3.4 樣品提取

提取。固體樣品與半固體樣品用均質(zhì)器均質(zhì)或粉碎機粉碎、黃油加熱融化后備用，液體樣品直接稱量。稱取5.00 g樣品于25 mL比色管，加入約15 mL水，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH 8.0后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶，用水定容至刻度，充分搖勻后超聲提取10 min。轉(zhuǎn)移至離心管，以8 000 r/min冷凍離心5 min，上清液備用。

QuEChERS凈化[12-14]。取3 mL離心后的上清液，加入0.2 g PSA粉末、0.2 g C18吸附劑和0.1 g GCB（對于含脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉較高的樣品可加0.4 g C18吸附劑），渦旋振蕩后以10 000 r/min離心2 min，取上清液過0.22 μm水相微孔濾膜后供液相色譜分析。

加標(biāo)回收試驗。分別稱取5 g蛋黃酥、蔬菜汁、黃油、辣椒醬、腐乳、火腿腸等樣品，加入相應(yīng)含量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，后面操作過程與樣品提取凈化過程相同。

檢出限。稱取5 g空白樣品，按加標(biāo)回收試驗的操作方法加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，提取凈化后用高效液相色譜分析，取脫氫乙酸色譜峰附近平穩(wěn)基線，得到信噪比，計算方法檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相條件的選擇

通過對中性、酸性、堿性流動相條件下脫氫乙酸在C18柱下分離情況的研究，發(fā)現(xiàn)堿性條件下脫氫乙酸色譜峰保留時間顯著減小，色譜峰對稱性顯著好于酸性及中性條件下，通過對色譜條件的進(jìn)一步優(yōu)化，結(jié)果見表1，最終選擇甲醇+0.02 mol/L的乙酸銨（5∶95）為流動相，用氨水調(diào)節(jié)流動相pH 8.0，在此條件下，色譜峰峰型良好，且該條件下進(jìn)行的多種樣品的加標(biāo)試驗顯示，脫氫乙酸峰無干擾峰影響，而其他條件下雖然峰型良好，但是保留時間太小，易產(chǎn)生干擾。圖1～圖5分別為該條件下脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、黃油、蛋黃酥、辣椒醬樣品加標(biāo)及GB 5009.121—2016方法中脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。

表1 流動相優(yōu)化結(jié)果

圖1 濃度4 mg/L脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 濃度3 mg/L黃油加標(biāo)樣品色譜圖

圖3 濃度6.9 mg/L蛋黃酥加標(biāo)樣品色譜圖

圖4 濃度4.0 mg/L辣椒醬加標(biāo)樣品色譜圖

圖5 GB 5009.121—2016中脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 線性關(guān)系

使用1.3.3中配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液對脫氫乙酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線，在最佳條件下以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)建立脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=29.942X-3.109，r=0.999 88，線性關(guān)系良好。

2.3 提取方法

使用QuEChERS凈化方法對提取樣品進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示對于普通樣品，取3 mL離心后上清液，加入0.2 g PSA粉末、0.2 g C18吸附劑和0.05 g GCB進(jìn)行處理，對于脂肪、蛋白質(zhì)、淀粉含量較高的樣品加入0.2 g PSA粉末、0.4 g C18吸附劑和0.05 g GCB進(jìn)行處理后，色譜峰無顯著基質(zhì)干擾，脫氫乙酸色譜峰無雜峰干擾。圖6和圖7分別為未經(jīng)QuEChERS凈化和經(jīng)過QuEChERS凈化后的樣品提取液加標(biāo)樣色譜圖，對比表明經(jīng)凈化后樣品雜峰明顯減少。

圖6 未經(jīng)QuEChERS凈化的蔬菜提取液色譜圖

圖7 經(jīng)QuEChERS凈化的蔬菜提取液加標(biāo)樣色譜圖

2.4 回收率試驗

在蛋黃酥、黃油、辣椒醬、蔬菜汁、腐乳及火腿腸等樣品中添加不同濃度的脫氫乙酸進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，蔬菜、辣椒醬的回收率較好，接近100%，而蛋黃酥、黃油樣品加標(biāo)回收率偏高。這是因為按照GB 5009.121—2016計算結(jié)果時，樣品提取液總體積V等于定容體積25 mL，實際檢測過程中對于液體樣品或含水分高的蔬菜汁等樣品提取液體積V接近25 mL，但是對于黃油、蛋黃酥等水分含量較低的樣品，提取液的真實體積V要遠(yuǎn)小于25 mL，計算時造成這類樣品回收率偏高，在檢測黃油等不含水或者含水量極低的樣品中脫氫乙酸時，可以將提取方法（取樣5 g后加入提取液（pH 8.0）定容至25 mL進(jìn)行提?。└臑槿? g后準(zhǔn)確加入25 mL提取液（pH 8.0）進(jìn)行提取，這樣在計算結(jié)果時提取液體積V=25 mL，結(jié)果更為準(zhǔn)確合理。

2.5 檢出限

不同樣品的檢出限見表3。方法檢出限在2.2×10-4～7.5×10-4g/kg之間，符合GB 5009.121—2016中液相色譜法的水平。

表2 脫氫乙酸加標(biāo)回收率結(jié)果與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

表3 脫氫乙酸檢出限

3 結(jié)論與討論

在脫氫乙酸的檢測中使用QuEChERS法進(jìn)行凈化并在弱堿性流動相條件下使用普通C18柱進(jìn)行樣品的分析。樣品在堿性條件下提取離心后，取上清液加入一定量的含PSA、C18和GCB粉末凈化，凈化液離心后過0.22 μm微孔濾膜后用于高效液相色譜儀分析，在此方法下，脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性、加標(biāo)回收率、檢出限均能達(dá)到GB 5009.121—2016水平，且脫氫乙酸色譜峰對稱性良好，附近無雜峰干擾。

方法與GB 5009.121—2016中液相色譜法相比具有優(yōu)點：（1）樣品前處理簡單方便省時，不需要SPE凈化柱，大大節(jié)省檢測成本；（2）不需要使用封端工藝的C18柱，在普通C18柱下分析脫氫乙酸色譜峰不拖尾，保留時間縮短，加快樣品的分析速度。對于食品中脫氫乙酸檢測方法的研究，國內(nèi)外也有許多學(xué)者做過相應(yīng)的研究，但是利用QuEChERS法凈化檢測食品中脫氫乙酸的方法未見報道。