量子點標記熒光免疫法檢測過氧化氫酶

李夢瑤 ，王書雅，謝云峰，張修珂，劉云國，翟晨*

1. 新疆大學生命科學與技術(shù)學院（烏魯木齊 830002）；2. 中糧營養(yǎng)健康研究院，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室（北京 102209）；3. 臨沂大學生命科學學院（臨沂 276000）

過氧化氫酶（CAT），是生物體系的關(guān)鍵防御酶之一[1]。由CAT構(gòu)成的酶保護系統(tǒng)可以消除植物細胞呼吸代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)，具有使植物免受氧化脅迫、提高植物抗逆水平和光合效率、增強植物防御能力、延緩衰老等作用[2-4]。果蔬采摘后，其后熟到劣變過程本質(zhì)是細胞呼吸代謝產(chǎn)物引起的氧化現(xiàn)象的發(fā)生。因此，CAT含量的變化是評判番茄等農(nóng)副產(chǎn)品新鮮度的一個重要指標。CAT含量的檢測多采用凝膠電泳法、免疫印跡法和考馬斯亮藍染色法等[5-7]。這些方法受主觀因素影響較大，且操作繁瑣、費時費力，不是一種理想的檢測方法。因此亟需開發(fā)一種準確、靈敏的檢測方法。

量子點（QDs）直徑介于1～10 nm，是一種受激發(fā)后可產(chǎn)生熒光的微納米材料[8]。作為一種新型熒光標記探針，具有高靈敏度、高熒光效率、獨特的光學性能、生物兼容性好等多種優(yōu)點[9,11]?；诹孔狱c熒光標記免疫分析技術(shù)在微生物檢測、農(nóng)獸藥殘留、蛋白類毒素、重金屬殘留等方面得到廣泛應(yīng)用，但對于蛋白酶類的分析檢測研究較少[10-15]。因此，試驗利用量子點標記過氧化氫酶合成量子點-過氧化氫酶（QDs-CAT）熒光探針，建立過氧化氫酶免疫熒光分析檢測的新方法，并對探針合成條件和檢測條件進行優(yōu)化，使得該方法具有較寬檢測范圍、低檢測限和高靈敏度，通過番茄樣品加標回收驗證量子點標記熒光免疫法檢測過氧化氫酶可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

F-7000型熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學儀器有限公司）；Synergy Mx熒光酶標儀（美國Bio-Tek公司）。

量子點（CdSe/ZnS，上海昆道生物科技有限公司）；過氧化氫酶、過氧化氫酶抗體（上海士峰生物科技有限公司）；1-乙基-（3-二甲氨基丙基）-碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（國藥集團化學試劑有限公司）；黑色96孔板（美國Corning公司）。

試驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 量子點熒光探針制備

量取100 μL 1 mg/mL量子點至700 μL 25 mmol/L pH 6.0 PBS 緩沖液中，加入100 μL 3 mg/mL NHS和100 μL 2 mg/mL EDC溶液，超聲分散均勻，置于30 ℃250 r/min恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)30 min，于8 000 r/min的離心機中常溫離心10 min，去掉上清液[16]。加入1 mL 100 μg/mL CAT抗原溶液復溶，超聲分散均勻，置于37 ℃ 250 r/min恒溫培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)1.5 h；反應(yīng)結(jié)束后在10 000 r/min下離心10 min，去除上清液中游離的過氧化氫酶。加入1 mL pH 7.4的PBST溶液，超聲分散均勻，在250 r/min，37 ℃搖床振蕩1 h，取出，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 熒光免疫檢測方法的建立

用pH 7.4、0.01 mol/L PBS緩沖液對過氧化氫酶抗體進行稀釋，以每孔100 μL加入酶標板中，4 ℃下包被過夜后，用含0.5%吐溫-20的0.01 mol/L pH 7.4的PBS洗滌3次并甩干，每孔加入250 μL的1% BSA，在37 ℃下對所述空白位點進行封閉1.5 h。洗板3次，每孔分別加入50 μL不同濃度的過氧化氫酶標準品溶液（樣品液）和50 μL QDs-CAT探針溶液（PBS 稀釋），在37 ℃下與包被在所述酶標板中的過氧化氫酶多克隆抗體進行競爭性地結(jié)合1 h[17]。洗滌3次并甩干，每孔加入100 μL PBS緩沖液，用熒光酶標儀激發(fā)并檢測所形成的抗體-抗原發(fā)光免疫復合物的熒光強度，其中激發(fā)波長375 nm，檢測波長622 nm。以一系列不同濃度的過氧化氫酶標準溶液中的過氧化氫酶的濃度為橫坐標，所獲得的熒光強度為縱坐標，繪制得到標準曲線。

1.3 方法學評價與應(yīng)用

1.3.1 特異性試驗

果蔬等樣品的粗提液基質(zhì)較為復雜，為了研究在最佳條件下其他物質(zhì)是否會干擾酶的檢測。試驗在相同條件下，對樣本中可能存在的干擾物質(zhì)，如離子（NaCl、KCl、CaCl2）、維生素C、葡萄糖、氨基酸（絲氨酸、蘇氨酸）進行探究。

1.3.2 番茄樣品加標回收和準確度試驗

取新鮮的番茄，洗凈晾干，于攪拌機中打碎10 min，冰浴狀態(tài)下用研缽研磨至泥狀。按料液比1∶2（g/g）稱取一定量番茄泥，加入樣品提取液（0.05 mol/L PBS緩沖液）在4 ℃高速離心機中以5 000 r/min進行離心30 min，取上清液作為樣本溶液。進行超高溫加熱處理，致使樣溶液中的過氧化氫酶失活，待其冷卻至室溫。添加過氧化氫酶標準品于樣本溶液中，采用建立的方法對樣本溶液進行分析。每份樣本進行5次平行試驗，并且連續(xù)3 d重復試驗，計算每個樣本的回收率以及批內(nèi)、批間的變異系數(shù)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 量子點-過氧化氫酶表征分析

由于量子點表面含有羧基官能團，其在活化劑NHS/EDC作用下，可與含有氨基的過氧化氫酶反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺鍵。通過對偶聯(lián)前后量子點的熒光強度進行比較（圖1），發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)前后的發(fā)射波長的峰位置沒有明顯紅移現(xiàn)象，且偶聯(lián)過程對量子點的熒光信號影響較小[16]。因此QDs-CAT熒光探針可用于免疫檢測。

2.2 參數(shù)優(yōu)化

2.2.1 NHS/EDC添加量的確定

NHS/EDC的添加量會影響量子點的熒光強度和量子點與過氧化氫酶的偶聯(lián)率。因此，保持其他試驗條件不變情況下，改變NHS/EDC添加量，對合成QDs-CAT熒光探針按照1.2方法進行免疫熒光檢測。結(jié)果表明（圖2 A）NHS/EDC的添加量10 μL時，即NHS/EDC的濃度分別為3和2 μg/mL，熒光強度較高，表明偶聯(lián)效果好且對量子點的熒光強度影響較小。

2.2.2 pH

體系的pH會影響過氧化氫酶的活性和量子點的熒光強度。在不同pH條件下，量子點與過氧化氫酶進行偶聯(lián)合成反應(yīng)，并對合成物進行免疫熒光分析。結(jié)果表明（圖2 B）在pH 7.4時，過氧化氫酶與抗體存在較好的特異性結(jié)合且熒光信號相對較高。因此，選擇pH 7.4的磷酸鹽緩沖液作為偶聯(lián)反應(yīng)的緩沖液。

2.2.3 抗體添加量

保持其他試驗條件不變情況下，優(yōu)化抗體添加量。結(jié)果如圖2C所示，熒光信號值隨著抗體濃度增加而增強，抗體濃度1 μg/mL時，熒光信號值達到最大；隨著抗體濃度繼續(xù)增加，熒光信號值降低。原因可能是空間位阻使得抗體與酶標板結(jié)合的穩(wěn)定性降低，在洗脫過程中大部分抗體被洗脫，導致抗原抗體量結(jié)合物減少且熒光強度信號值減低。故初選抗體濃度1 μg/mL。

2.2.4 熒光探針QDs-CAT添加量

由于是采用競爭法對CAT進行檢測，QDs-CAT熒光探針的添加量將直接影響試驗結(jié)果。因此，通過抗體與含有不同濃度QDs-CAT熒光探針孵育，進行熒光檢測，確定QDs-CAT最佳添加量。結(jié)果如圖2D所示，熒光信號值隨著QDs-CAT熒光探針添加量增加而增強，QDs-CAT添加量10 μg/mL時，熒光信號達到最值，繼續(xù)增大QDs-CAT添加量，熒光信號值的強度基本不變。為了節(jié)約試驗成本，選擇10 μg/mL濃度的QDs-CAT進行試驗研究。

2.2.5 BSA濃度的確定

封閉液能降低非特異性結(jié)合，提高檢測靈敏度。試驗在其他條件不變情況下，以未進行封閉處理的作為對照試驗，由圖2E可知，由于非特異性吸附導致熒光信號值較高；與對照孔相比，進行封閉處理的微孔中的熒光信號值顯著降低。BSA封閉液的濃度≥1%時，其熒光信號值與對照孔的差異最明顯。考慮到試驗成本，因此確定選擇1% BSA作為封閉液。

2.2.6 檢測時間選擇

孵育時間影響抗原抗體復合物的形成，且對試驗的熒光信號值有重要的影響。因此，試驗在其他條件不變的情況下，對孵育時間進行考察。由圖2F可知，熒光信號值隨著孵育時間增加而增強，在60 min時，熒光信號值達到最大，繼續(xù)延長孵育時間，熒光強度變化不大，表明抗原抗體結(jié)合基本達到穩(wěn)定，因此試驗選擇60 min作為抗原抗體孵育時間。

圖1 量子點偶聯(lián)前后熒光光譜圖

圖2 單因素試驗結(jié)果

2.3 免疫熒光檢測方法建立

在最佳反應(yīng)條件下（pH 7.4 PBS中37 ℃反應(yīng)60 min），考察探針對不同濃度的過氧化氫酶標準溶液（0，0.05，0.1，1，50，100，200，400，600，800和1 000 μg/mL）的熒光光譜信號的變化，如圖3所示。

圖3 過氧化氫酶的熒光光譜圖和線性關(guān)系圖

過氧化氫酶濃度在1～1 000 μg/mL的范圍內(nèi)，探針的熒光光譜信號呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程ΔF=0.593 7C+154.3（R2=0.994 2），式中：ΔF是探針在有無過氧化氫酶存在的條件下其熒光強度光譜信號的變化；C為過氧化氫酶濃度（μg/mL）。其最低檢測限為2.5×10-2μg/mL。

2.4 特異性試驗

試驗空白對照孔熒光強度F0，含有不同種類離子（30 μmol/L的KCl、CaCl2、NaCl，15 mmol/L的維生素C（VC）、葡萄糖、絲氨酸、蘇氨酸）和200 μg/mL的蛋白樣本溶液的熒光強度F，以相對熒光強度ΔF（ΔF=F0-F）考察不同抗原對免疫檢測熒光強度的影響[19-20]。如圖4所示，含有CAT試樣的熒光響應(yīng)信號值較高，其它干擾物質(zhì)的熒光強度都低于50，表明該方法有較好的選擇專一性。

圖4 干擾物的熒光響應(yīng)信號圖

2.5 樣品加標回收和準確度試驗結(jié)果

試驗中對不同批次的番茄提取液進行了加標回收。采用所建立的方法進行檢測，試驗結(jié)果如表1所示。應(yīng)用該方法檢測得到的回收率＞90%，且批內(nèi)、批間變異系數(shù)均＜15%，說明建立的方法準確度好，可應(yīng)用于實際樣品中CAT的檢測。

表1 番茄中過氧化氫酶的添加回收率和變異系數(shù)

3 討論

試驗建立一種過氧化氫酶量子點熒光免疫檢測方法。試驗以熒光強度為指標，對熒光探針合成條件和免疫熒光分析檢測條件等參數(shù)進行優(yōu)化。在最佳條件下建立過氧化氫酶檢測模型，方法線性范圍為1～1 000 μg/mL，相關(guān)系數(shù)為0.994 2，最低檢測限可達2.5×10-2μg/mL，并對番茄樣品進行加標回收試驗，結(jié)果表明該方法回收率高，且具有較好的穩(wěn)定性和特異性。可以初步實現(xiàn)對過氧化氫酶的定量，為實際檢測節(jié)省大量時間，適用于大樣本快速檢測，具有良好的應(yīng)用前景。

量子點因其獨特的光學性質(zhì)，以及與蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)日趨成熟，其在免疫分析中的應(yīng)用也愈加廣泛。量子點免疫熒光法與傳統(tǒng)的ELISA和熒光方法相比，具有分析時間短、檢測限低、步驟簡單、可直觀檢測等優(yōu)點，同時該方法也為用于其他蛋白酶類的定量熒光免疫檢測提供參考。

4 結(jié)論

試驗基于量子點熒光探針，結(jié)合免疫熒光法，建立了番茄中過氧化氫酶的熒光檢測技術(shù)。通過對試驗中的各種影響因素、探針的特異性、樣品加標回收、批內(nèi)和批間變異系數(shù)等指標進行探討，證實了該方法操作簡單、線性范圍寬、回收率高、變異系數(shù)＜15%，且具有較好的特異性和準確度，為過氧化氫酶含量檢測提供了一種新方法。