響應(yīng)面法優(yōu)化蘆丁的熒光檢測(cè)條件

張換平，杜慧，申艷紅，康榮

安陽工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院（安陽 455000）

中藥的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取過程中，蘆丁是經(jīng)常被用來作為檢測(cè)對(duì)照品的物質(zhì)[1]，優(yōu)化蘆丁的檢測(cè)條件對(duì)黃酮類物質(zhì)的測(cè)定尤其重要。由于不同的中藥中所含的黃酮類物質(zhì)種類、含量各不相同，在對(duì)黃酮類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)可選用的檢測(cè)方式就有所不同，由于蘆丁能與鋁離子結(jié)合生成一種具有熒光特性且較穩(wěn)定的絡(luò)合物[2]，對(duì)于常用的紫外檢測(cè)[3]、熒光檢測(cè)[4]、液相色譜檢測(cè)[5]等的檢測(cè)方式中，熒光檢測(cè)就備受青睞，試驗(yàn)借助熒光分光光度計(jì)對(duì)蘆丁進(jìn)行檢測(cè)時(shí)的溶劑及發(fā)生熒光反應(yīng)時(shí)的條件進(jìn)行優(yōu)化[6]，為黃酮類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)、測(cè)量時(shí)提供可參考的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘆?。ā?8%，阿拉?。惶J丁溶液（質(zhì)量濃度3.026 mg/mL）；其他試劑均為分析純。

F-7000型分子熒光光度計(jì)（日本日立高新技術(shù)公司）；FA10048型電子分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定原理

黃酮類化合物本身的熒光強(qiáng)度很小，而鋁離子與黃酮苷類物質(zhì)（蘆丁）在酸性或弱堿性條件下能形成具有熒光特性的絡(luò)合物，可用于熒光檢測(cè)。在398 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下，用熒光光度計(jì)（激發(fā)、發(fā)射光譜狹縫均為10 nm）在一定條件下對(duì)生成的蘆丁熒光絡(luò)合物進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)定，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小優(yōu)化蘆丁的最佳檢測(cè)條件。

1.2.2 蘆丁檢測(cè)條件的單因素試驗(yàn)

在蘆丁與硝酸鋁形成蘆丁熒光絡(luò)合物的反應(yīng)體系中，分別對(duì)緩沖溶液加入量、緩沖溶液pH、0.5%硝酸鋁溶液用量、反應(yīng)時(shí)間、蘆丁溶液的濃度等單因素進(jìn)行考察。

1.2.2.1 緩沖溶液pH的影響

準(zhǔn)確移取6份3.026 mg/mL的蘆丁溶液0.145 mL，分別加入0.1 mL 0.5%硝酸鋁溶液，及1 mL不同pH的緩沖溶液后，用50%乙醇定容至10 mL，振蕩均勻、靜置15 min后，測(cè)定不同pH的緩沖溶液對(duì)蘆丁熒光絡(luò)合物的影響，根據(jù)測(cè)得熒光強(qiáng)度的大小選擇緩沖溶液的最優(yōu)pH。

1.2.2.2 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液加入量的影響

準(zhǔn)確移取6份3.026 mg/mL的蘆丁溶液0.145 mL，分別加入0.1 mL 0.5%硝酸鋁溶液，及pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液0.1，0.3，0.5，0.7，0.9和1.0 mL，用50%乙醇溶液定容至10 mL，振蕩均勻、靜置15 min后，測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小判斷緩沖溶液最佳加入量。

1.2.2.3 濃度0.5%硝酸鋁溶液用量的影響

準(zhǔn)確移取7份3.026 mg/mL的蘆丁溶液0.145 mL，分別加入0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5 mL 0.5%硝酸鋁溶液，加入pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液0.9 mL，用50%乙醇溶液定容至10 mL，振蕩均勻、靜置15 min后，測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小判斷0.5%硝酸鋁溶液的最佳用量。

1.2.2.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響

準(zhǔn)確配制14組在所得到的最佳試劑條件下的硝酸鋁和蘆丁生成的熒光絡(luò)合物溶液，在不同反應(yīng)時(shí)間下測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小判斷最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.2.5 不同質(zhì)量濃度的蘆丁溶液的影響

準(zhǔn)確移取3.026 mg/mL的蘆丁溶液0.145，0.125，0.110和0.100 mL，分別加入0.1 mL 0.5%硝酸鋁溶液，及pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液0.9 mL后，用50%乙醇溶液定容至10 mL，振蕩均勻、靜置60 min后，測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小判斷蘆丁溶液的最佳濃度。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化蘆丁的檢測(cè)條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選定3個(gè)主要影響因素，蘆丁質(zhì)量濃度、硝酸鋁用量、緩沖溶液pH這3個(gè)因素為自變量，以生成的絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度為響應(yīng)值，采用三因素三水平響應(yīng)面[7]分析法模型，擬合最佳的測(cè)試條件，響應(yīng)面法因素水平見表1。

表1 因素與水平

2 結(jié)果與分析

在激發(fā)波長(zhǎng)398 nm下，分別對(duì)空白溶液以及蘆丁熒光絡(luò)合物溶液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，從圖1的熒光圖譜中發(fā)現(xiàn)在510～550 nm發(fā)射波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行蘆丁絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度測(cè)定時(shí)溶液中其他成分基本不干擾測(cè)定。

2.1 單因素試驗(yàn)檢測(cè)

2.1.1 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的pH影響

在激發(fā)波長(zhǎng)398 nm檢測(cè)條件下，不同pH的緩沖溶液對(duì)熒光強(qiáng)度的影響如圖2所示。熒光強(qiáng)度隨酸性減弱呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)，pH 5.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。

2.1.2 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液加入量的影響

在激發(fā)波長(zhǎng)398 nm，緩沖液pH 5.5的檢測(cè)條件下，醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的加入量變化對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響結(jié)果如圖3所示。蘆丁檢測(cè)的熒光強(qiáng)度隨緩沖溶液加入量增加而增大，加入量達(dá)到0.9 mL時(shí)，熒光強(qiáng)度值最大，超過0.9 mL，熒光強(qiáng)度明顯減小。

圖1 空白溶液的熒光對(duì)照?qǐng)D譜

圖2 不同pH的緩沖溶液對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響

圖3 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液加入量對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響

2.1.3 濃度0.5%硝酸鋁溶液用量對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響

在398 nm的激發(fā)波長(zhǎng)，0.9 mL pH 5.5的緩沖溶液檢測(cè)條件下，硝酸鋁用量變化對(duì)測(cè)定的影響結(jié)果如圖4所示。蘆丁檢測(cè)的熒光強(qiáng)度隨硝酸鋁用量的增加而增大，用量達(dá)到2.5 mL，檢測(cè)熒光強(qiáng)度最大，超過2.5 mL，檢測(cè)熒光強(qiáng)度隨硝酸鋁用量增加反而降低。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響

在激發(fā)波長(zhǎng)398 nm，0.9 mL pH 5.5的緩沖溶液，2.5 mL濃度0.5%硝酸鋁溶液的檢測(cè)條件下，反應(yīng)時(shí)間對(duì)熒光測(cè)定的影響結(jié)果如圖5所示。熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間增加而增大，靜置時(shí)間60～65 min時(shí)，熒光強(qiáng)度最大，超過65 min，熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增加反而降低?？紤]到實(shí)際試驗(yàn)中所存在的誤差，最佳反應(yīng)時(shí)間選用60 min。

圖4 硝酸鋁溶液用量對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蘆丁檢測(cè)的影響

2.1.5 不同蘆丁質(zhì)量濃度對(duì)檢測(cè)的影響

在激發(fā)波長(zhǎng)398 nm，靜置反應(yīng)時(shí)間60 min，硝酸鋁用量2.5 mL，pH 5.5緩沖溶液體積0.9 mL的測(cè)定條件下，不同濃度的蘆丁溶液對(duì)熒光強(qiáng)度的影響結(jié)果如圖6所示。在蘆丁稀釋質(zhì)量濃度從30.26～43.87 mg/L的變化范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨著蘆丁質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)先增大后減小趨勢(shì)，最佳質(zhì)量濃度為37.83 mg/L。

圖6 蘆丁質(zhì)量濃度對(duì)黃酮檢測(cè)的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化分析蘆丁的檢測(cè)條件

利用響應(yīng)面法優(yōu)化軟件Design-Expert. V 8.0.6.1對(duì)表1的三因素三水平設(shè)計(jì)的17組試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2所示。

表2 黃酮檢測(cè)條件響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面法分析，得到蘆丁絡(luò)合物熒光強(qiáng)度與所選三因素之間的二次項(xiàng)回歸方程為：F=374.32-2.45A+10.15B+70.28C-2.10AB-1.00AC+20.45BC-11.91A2-28.91B2-176.71C2。方程的各系數(shù)絕對(duì)值大小反映出各因素對(duì)蘆丁絡(luò)合物熒光強(qiáng)度的影響。對(duì)表2進(jìn)行檢驗(yàn)?zāi)Ｐ陀行Х治?，分析結(jié)果見表3。

從表3可以得到試驗(yàn)?zāi)Ｐ头治龅腇=280.53，且概率p＜0.000 1，說明該模型具有極高的顯著性。其次，數(shù)據(jù)擬合分析中的失擬項(xiàng)F=6.19，概率p＞0.05，顯示失擬項(xiàng)并不顯著，說明在回歸區(qū)域中回歸方程的擬合性比較好。一次項(xiàng)中最顯著因素是C緩沖溶液pH，較顯著因素是B硝酸鋁用量，二次項(xiàng)中最顯著因素和較顯著因素與一次項(xiàng)相同，說明3因素分別對(duì)熒光檢測(cè)結(jié)果的影響程度。

表3 響應(yīng)面回歸模型ANOVA分析結(jié)果

從曲面圖和對(duì)應(yīng)的等高線圖，可進(jìn)一步進(jìn)行直觀分析。從圖7和圖8，可以看到蘆丁質(zhì)量濃度與0.5%硝酸鋁用量的曲面圖曲面比較平緩，陡峭幅度較小，等高線圖形雖然是橢圓形但橢圓程度不大，說明兩者之間的相互作用不是很顯著。

圖7 硝酸鋁用量和蘆丁質(zhì)量濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的響應(yīng)面圖

圖8 硝酸鋁用量和蘆丁質(zhì)量濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的等高線圖

在圖9和圖10中，蘆丁質(zhì)量濃度與緩沖溶液pH的曲面圖陡峭程度比較好，對(duì)應(yīng)的等高線圖形呈現(xiàn)橢圓，隨著緩沖液pH的改變，蘆丁檢測(cè)的熒光強(qiáng)度變化比較大，顯示兩者之間的交互作用較好。

圖9 緩沖液pH和蘆丁質(zhì)量濃度對(duì)熒光強(qiáng)度影響的響應(yīng)面圖

圖10 緩沖溶液pH和蘆丁質(zhì)量濃度對(duì)熒光強(qiáng)度影響的等高線圖

在圖11和圖12中，緩沖溶液pH與0.5%硝酸鋁用量之間，曲面圖同樣比較陡峭，并且對(duì)應(yīng)的等高線圖形明顯呈現(xiàn)橢圓狀，說明兩者之間的交互作用較顯著。

圖11 緩沖溶液pH和硝酸鋁用量對(duì)熒光強(qiáng)度影響的響應(yīng)面圖

圖12 緩沖溶液pH和硝酸鋁用量對(duì)熒光強(qiáng)度影響的等高線圖

3 結(jié)論

通過在對(duì)影響蘆丁檢測(cè)的各單因素進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化軟件Design-Expert. V 8.0.6.1對(duì)蘆丁質(zhì)量濃度、緩沖溶液pH，硝酸鋁溶液的用量3個(gè)因素進(jìn)行3水平優(yōu)化設(shè)計(jì)，并對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行討論，對(duì)各因素相互作用的響應(yīng)面圖及等高線圖進(jìn)行析，發(fā)現(xiàn)蘆丁質(zhì)量濃度對(duì)檢測(cè)條件影響不大，0.5%硝酸鋁用量因素的影響較大，緩沖溶液pH的影響效果最顯著，且蘆丁的最佳檢測(cè)工藝條件為：蘆丁質(zhì)量濃度37.78 mg/L，0.5%硝酸鋁2.76 mL，緩沖溶液pH 5.61。