雙果顆粒劑的提取工藝及定量分析

王曉林，戴鸝瑩，鐘方麗，余西亞，魏曉芳，呂艷欣

吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院（吉林 132022）

雙果顆粒劑是以黑果（黑果腺肋花楸果）、刺玫果為主要原料制成的保健食品，具有抗氧化作用，其中刺玫果富含維生素類、黃酮類物質(zhì)，其維生素C及維生素E的含量非常豐富，遠高于蘋果、彌猴桃等水果，被稱為天然多種維生素濃縮物[1-2]。魏穎等[3]的研究結(jié)果表明刺玫果是一種同時具有免疫抑制和抗氧化活性的可在保健食品中添加的中藥材，可用于免疫調(diào)節(jié)和抗氧化功能保健食品的開發(fā)。張遠等[4]的研究結(jié)果表明刺玫果可視為沒有毒性。黑果腺肋花楸果含有多種酚類營養(yǎng)物質(zhì)[5]，特別是原花青素含量豐富，占總酚的41%以上[6]，原花青素具有抗氧化、防治心血管疾病等生物活性[7-8]，尤其是其抗氧化能力非常高，是維生素E的50倍、維生素C的20倍，是最好的天然抗氧化劑之一[9]。應(yīng)用“抗氧化劑+免疫調(diào)節(jié)劑”可以輔助治療糖尿病、高血壓等多種疾病，所以加強食源性“抗氧化劑+免疫調(diào)節(jié)劑”的研發(fā)是當(dāng)前研究熱點之一，而黑果+刺玫果組合完全符合這種理念。雙果顆粒劑將黑果、刺玫果合用，在抗氧化、增強免疫力等方面起到“1+1大于2”的作用[10]。此次試驗以黑果、刺玫果為主要原料，利用正交試驗法，探究其活性成分原花青素、總黃酮的提取工藝，同時對雙果顆粒劑的制備工藝及其質(zhì)量進行研究，為雙果顆粒劑的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果（Fruit ofRosa davuricaPall.）采自吉林省吉林市豐滿區(qū)小白山，經(jīng)吉林化工學(xué)院藥學(xué)系薛健飛博士鑒定，為薔薇科植物山刺玫的果實；黑果腺肋花楸果，吉林省黑果花楸農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限責(zé)任公司；原花青素、蘆丁對照品，成都曼斯特生物科技有限公司；微晶纖維素，上海康達食品工程有限公司；甘露醇，河南中泰食化有限公司；甜菊糖，天津雙味食品廠；水為重蒸餾水；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1950紫外-可見光光度分析儀，TU-1950型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，XMTD-8222型，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；電子分析天平，F(xiàn)A2004N型，上海精密科學(xué)儀有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE-52C型，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 提取工藝研究

1.3.1.1 單因素試驗

分別稱取5 g刺玫果和2 g黑果，以原花青素和總黃酮的總提取率為考察指標(biāo)，只改變提取溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)（0，20%，40%，60%和80%），只改變料液比（1∶3，1∶5，1∶7，1∶9，1∶11和1∶13 g/mL），只改變水浴溫度（50，60，70，80和85 ℃），只改變提取時間（0.5，1，2，3，4，5和6 h），只改變提取次數(shù)（1，2，3和4次），按照提取工藝提取，計算原花青素和總黃酮的總提取率。

1.3.1.2 正交及工藝驗證性試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，通過正交試驗進一步優(yōu)化雙果顆粒劑的提取工藝，固定水浴溫度80 ℃、提取次數(shù)1次，選擇料液比（A）、提取時間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）作為考察因素，以原花青素和總黃酮的總提取率為考察指標(biāo)，確定最佳的雙果顆粒劑提取工藝。所確定的因素與水平見表1。然后按照正交試驗篩選的最佳提取工藝制備3批雙果提取物，考察提取工藝的穩(wěn)定性。

表1 因素水平表

1.3.1.3 提取與干燥方式的選擇

以出膏率、浸膏中原花青素和總黃酮的含量、原花青素和總黃酮的總提取率為考察指標(biāo)，比較70%乙醇溶液回流提取與水提醇沉方式對雙果顆粒劑的提取效果；比較常壓干燥、常壓加微晶纖維素干燥、真空干燥、冷凍干燥的效果。

1.3.2 顆粒劑中原花青素和總黃酮的定量分析

1.3.2.1 雙果顆粒劑的制備

取適量黑果、刺玫果，加入60%乙醇水溶液，在80 ℃水浴中提取3次，每次2 h。過濾，濾液合并，于80 ℃水浴減壓濃縮至相對密度1.01～1.05（60 ℃），加入微晶纖維素拌勻，于60 ℃烘箱減壓干燥，粉碎過篩，加入適量甘露醇混合均勻，用含有適量甜菊糖的70%的乙醇溶液制軟材，于20目篩制粒，過篩，烘干，整粒，即得。

1.3.2.2 雙果顆粒劑含量測定方法的選擇

根據(jù)參考文獻對3種常見的總黃酮含量測定方法亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉顯色法[11]、三氯化鋁-醋酸、醋酸鈉顯色法[12]、紫外法[13]進行考察。

針對雙果顆粒劑中原花青素含量測定，考察了鐵鹽催化比色法[14]、香草醛-鹽酸顯色法[15]、高鐵鹽-鐵氰化鉀分光光度法[16]。

1.3.2.3 含量測定的方法學(xué)研究

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5和4.0 mL 0.1 mg/mL蘆丁對照品溶液，置于25 mL容量瓶中，在30 ℃水浴中加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，振蕩后放置5 min，再加入1 mL硝酸鋁溶液，6 min后加入10 mL 10%氫氧化鈉溶液，用30%乙醇稀釋定容至刻度，搖勻，放置15 min。以30%乙醇為空白，按照紫外分光光度法，在510 nm處測定吸光度[11]。

精密量取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 mL 0.4 mg/mL原花青素對照品溶液，置于25 mL具塞瓶中，吸取6 mL反應(yīng)混合液、0.5 mL硫酸鐵銨溶液分別于兩個具塞管中，混勻，沸水浴中加熱40 min后，迅速冷卻，以0.0 mL溶液為空白，按照紫外分光光度法，在550 nm處測定其吸光度[14]。

（2）穩(wěn)定性試驗

精密移取適量雙果顆粒劑供試品溶液于容量瓶中，分別在0，30，60，120，180，240，300和360 min按照總黃酮、原花青素的顯色方法進行顯色，以不顯色的供試品溶液為空白，按照紫外可見分光光度法，總黃酮在510 nm、原花青素在550 nm處測定其吸光度A（每組數(shù)據(jù)測定3次，取其平均值），考察雙果顆粒劑供試品溶液顯色前的穩(wěn)定性。

精密移取適量雙果顆粒劑供試品溶液于容量瓶中，按照總黃酮、原花青素的顯色方法進行顯色，以不顯色的供試品溶液為空白，分別在顯色后0，15，30，45，60，75和90 min，按照紫外可見分光光度法，總黃酮在510 nm、原花青素在550 nm處測定其吸光度A，考察雙果顆粒劑供試品溶液顯色后的穩(wěn)定性。

（3）儀器精密度試驗

移取0.4 mL供試品溶液，分別按照總黃酮、原花青素含量測定方法顯色，以不顯色的供試品溶液為空白，分別在510和550 nm處測定其吸光度，連續(xù)測定6次，考察儀器精密度。

（4）重現(xiàn)性試驗

精密移取0.4 mL同一供試品溶液于6個25 mL容量瓶中，按照總黃酮含量測定方法顯色，以未顯色的供試品溶液為空白，按照紫外可見分光光度法，在510 nm處測定其吸光度；精密移取6份1.0 mL供試品溶液于具塞管中，按照原花青素含量測定方法進行顯色，以未顯色的供試品溶液作空白對照，按照紫外分光光度法，在550 nm處測定其吸光度。

（5）加樣回收率試驗

精密稱定9份已知含量的雙果顆粒劑，每3份樣品中加入總黃酮、原花青素質(zhì)量的50%，100%和150%的蘆丁、原花青素對照品，按供試品溶液制備方法制備9份供試品溶液，吸取1.0 mL供試品溶液，按照總黃酮、原花青素含量測定方法顯色，以不顯色的供試品溶液為空白，按照紫外分光光度法，分別在510和550 nm處測定其吸光度。計算出每份中原花青素的含量，計算出回收率。

（6）最低檢出限、定量限的確定

精密移取總黃酮、原花青素含量測定方法中的空白，連續(xù)測定20次，記錄吸光度，按式（1）和式（2）計算最低檢出限和定量限

檢出限=[3×空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（一般平行測定20次得到）]/方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率 （1）

定量限=[10×白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（一般平行測定20次得到）]/方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率 （2）

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝試驗結(jié)果

2.1.1 提取工藝的單因素試驗結(jié)果

單因素試驗結(jié)果表明，雙果顆粒劑有效成分的提取溶劑為60%乙醇水溶液，料液比為1∶11（g/mL），提取水浴溫度為80 ℃，提取時間為每次5 h，提取次數(shù)為3次。具體結(jié)果見圖1～圖5。

圖1 提取溶劑的選擇

圖2 料液比的選擇

2.1.2 提取工藝的正交試驗及工藝驗證性試驗結(jié)果

取適量黑果、刺玫果，固定水浴溫度80 ℃、提取1次，其他各影響因素按正交試驗表進行試驗，正交試驗結(jié)果分析見表2。結(jié)果顯示，各因素對雙果顆粒劑活性成分的提取效果均有一定的影響，影響大小順序為B＞A＞C，最佳提取條件為A3B2C3，即料液比為1∶13（g/mL）、提取時間為5.0 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。3次工藝驗證性試驗中雙果顆粒劑總提取率分別為183.60 mg/g（其中總黃酮提取率為74.31 mg/g，原花青素提取率為109.29 mg/g），187.75 mg/g（其中總黃酮提取率為77.08 mg/g，原花青素提取率為110.67 mg/g）和182.08 mg/g（其中總黃酮提取率為75.15 mg/g，原花青素提取率為106.93 mg/g），總提取率平均值為184.48 mg/g，RSD為1.60%，說明優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

圖3 提取溫度的選擇

圖4 提取時間的選擇

圖5 提取次數(shù)的選擇

表2 正交試驗結(jié)果分析表

2.1.3 提取與干燥方式的試驗結(jié)果

提取試驗結(jié)果表明，70%乙醇溶液回流提取的出膏率、浸膏中原花青素和總黃酮的含量、原花青素和總黃酮的總提取率均高于水提醇沉方式，試驗結(jié)果見表3。

表3 提取方式試驗結(jié)果

浸膏干燥方式對比試驗結(jié)果表明，加入微晶纖維素（MCC）于60 ℃真空干燥效果較好，試驗結(jié)果見表4。干燥溫度及時間對浸膏中原花青素的含量有明顯的影響，干燥溫度越低，干燥時間越短，浸膏中原花青素的含量越高，而干燥溫度及時間對浸膏中總黃酮的含量影響較小。

表4 干燥方式試驗結(jié)果

2.2 顆粒劑的定量分析試驗結(jié)果

2.2.1 雙果顆粒劑總黃酮、原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別以蘆丁對照品濃度、原花青素對照品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，分別繪制總黃酮、原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？傸S酮、原花青素的線性回歸方程分別為：A=10.516C-0.008 8，r=0.999 6；A=24.179C+0.044 2，r=0.999 5。結(jié)果表明，總黃酮在0.002～0.016 mg/mL、原花青素在0.006 1～0.038 89 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 重復(fù)性試驗

供試品溶液中總黃酮的吸光度分別為0.571，0.565，0.606，0.592，0.563和0.554，平均值為0.575；供試品溶液中原花青素的吸光度分別為0.522，0.541，0.516，0.529，0.533和0.547，平均值為0.531，RSD分別為3.43%和2.18%，結(jié)果表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.2.3 儀器精密度試驗

供試品溶液中總黃酮的6次吸光度分別為0.566，0.562，0.563，0.563，0.567和0.565，平均值為0.564；供試品溶液中原花青素的6次吸光度分別為0.655，0.654，0.654，0.654，0.654和0.655，平均值為0.654，RSD值分別為2.05%和0.079%。結(jié)果表示儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗

供試品溶液中總黃酮顯色前在0，30，60，120，180，240，300和360 min的吸光度分別為0.565，0.564，0.562，0.562，0.551，0.553，0.568和0.675；供試品溶液中原花青素顯色前在0，30，60，120，180，240，300和360 min的吸光度分別為0.490，0.483，0.493，0.511，0.482，0.500，0.486和0.497。結(jié)果表明，供試品溶液顯色前300 min內(nèi)總黃酮穩(wěn)定性良好、顯色前360 min內(nèi)原花青素穩(wěn)定性良好。供試品溶液中總黃酮顯色后在0，15，30，45，60，75和90 min的吸光度分別為0.569，0.554，0.547，0.543，0.517，0.514和0.506；供試品溶液中原花青素顯色后在0，15，30，45，60，75和90 min的吸光度分別為0.400，0.405，0.391，0.399，0.383，0.372和0.370。結(jié)果表明，測定總黃酮時供試品溶液顯色后在15～60 min間應(yīng)完成吸光度的測定，測定原花青素含量時供試品溶液顯色后應(yīng)在60 min內(nèi)完成吸光度的測定。

2.2.5 加樣回收率試驗

表5 加樣回收率結(jié)果

原花青素、總黃酮的平均加樣回收率分別為99.24%和98.66%，RSD值分別為2.33%和1.22%。具體試驗結(jié)果見表5。

2.2.6 最低檢出限、定量限的檢測結(jié)果

試驗結(jié)果表明：雙果顆粒劑總黃酮、原花青素含量測定方法的檢出限分別為0.000 55和0.000 20，定量限分別為0.001 83和0.000 68。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

3.1.1 干燥方式對總黃酮和原花青素含量的影響

在干燥方式選擇試驗中，由試驗結(jié)果可知干燥溫度及時間對原花青素的含量影響較高，干燥溫度越高、時間越長，原花青素的含量越低，所以雙果顆粒劑浸膏的干燥溫度應(yīng)低于60 ℃，如果干燥溫度高于60 ℃，原花青素的損失較大。另外，干燥時間超過12 h，原花青素的含量也較低，所以試驗中采用微晶纖維素作為輔干劑，在真空干燥的同時可以明顯縮短干燥時間，提高原花青素的含量，當(dāng)然冷凍干燥中原花青素的含量最高，但冷凍干燥時間長，效率低，所以試驗中未采用。在60 ℃干燥溫度下，各種干燥方式對總黃酮的含量影響較小，說明雙果提取物中的黃酮類化合物比較穩(wěn)定。

3.1.2 雙果顆粒劑中原花青素和總黃酮含量測定方法的確定

通過蘆?。傸S酮）對照品溶液、原花青素對照品溶液、供試品溶液的顯色前后的紫外可見光譜及顯色劑的紫外可見光譜的峰型對比、最大吸收峰重合度、雜質(zhì)峰干擾等情況考慮，總黃酮含量測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法，原花青素含量測定采用鐵鹽催化比色法，上述2種方法中顯色后的供試品溶液、對照品溶液總黃酮在510 nm、原花青素在550 nm附近有明顯的最大吸收峰，峰形相似，且無其他雜質(zhì)峰干擾，而顯色劑、未顯色的對照品溶液及供試品溶液在最大吸收峰處無干擾，因此最終選擇亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法作為雙果顆粒劑中總黃酮含量測定方法，檢測波長選擇對照品顯色后的波長510 nm；選擇鐵鹽催化比色測定法作為雙果顆粒劑中原花青素含量測定方法，檢測波長選擇對照品顯色后的波長550 nm。

3.2 結(jié)論

通過單因素試驗與正交試驗相結(jié)合的方法對雙果顆粒劑的提取工藝進行了相關(guān)的探索，并以總黃酮和原花青素的總提取率為考察指標(biāo)確定了最佳工藝條件為：提取溶劑為體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇，料液比為1∶13（g/mL），提取水浴溫度為80 ℃，提取3次，每次5.0 h，在上述工藝條件下，總黃酮和原花青素的總提取率可以達到184.48 mg/g。采用紫外-可見分光光度法對雙果顆粒劑中總黃酮和原花青素的含量測定方法進行了相關(guān)的探索，并建立了雙果顆粒劑中總黃酮和原花青素的含量測定方法。此次試驗建立的UV高含量方法線性關(guān)系良好，回收率、重復(fù)性均符合規(guī)定，可作為雙果顆粒劑的質(zhì)量控制方法。