定喘湯對哮喘模型小鼠肺組織炎性因子及NLRP3炎癥小體的影響

李 江 顏延鳳

支氣管哮喘(哮喘)是呼吸內(nèi)科常見的慢性非感染性氣道炎癥，發(fā)生機(jī)制常與變態(tài)反應(yīng)有關(guān)，其病變特征為嗜酸性粒細(xì)胞和2型輔助型T細(xì)胞(T helper cell type 2,Th2)因子(包括白細(xì)胞介素3、4、5)產(chǎn)生增加，促進(jìn)免疫球蛋白E(IgE)形成，導(dǎo)致Th2細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞發(fā)育、成熟和激活，引起氣道高反應(yīng)性、黏液產(chǎn)生和氣道重塑[1]。中藥湯劑定喘湯對輕、中、重度哮喘均有顯著療效，但機(jī)制尚不明確[2]。有研究顯示，定喘湯能抑制炎癥細(xì)胞在氣道黏膜及周圍組織浸潤,抑制氣道重塑[3]。

Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein3，NLRP3)在Nod受體蛋白家族中較為獨(dú)特，與其他Nod受體蛋白啟動(dòng)條件較為單一不同，它存在多種激活方式，參與影響多種疾病，具體激活機(jī)制尚未明確。有文獻(xiàn)記載，NLRP3與多種肺部疾病發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系，NLRP3的下游產(chǎn)物IL-1β能促IL-17分化及炎癥細(xì)胞聚集，在哮喘的疾病進(jìn)程中起重要作用[4]。本實(shí)驗(yàn)制備小鼠哮喘模型，通過檢測其不同時(shí)期NLRP3的蛋白表達(dá)水平及相關(guān)產(chǎn)物(IL-1β，IL-17)含量的變化，同時(shí)觀察氣道黏膜及周圍組織的形態(tài)，研究定喘湯能否有效抑制NLRP3及相關(guān)產(chǎn)物，肺組織炎癥及氣道重塑，探討定喘湯治療哮喘的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器石蠟包埋及切片機(jī)(德國Leica公司)；正置顯微鏡(德國Leica公司)；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)(美國Media Cybernetics公司)； 蛋白電泳儀及電泳槽(美國Bio-RAD公司)，BIO-RAD ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.1.2 主要試劑卵清蛋白(OVA，grade Ⅴ,美國Sigma公司)，明礬佐劑(Imject Alum,美國Pierce公司)，內(nèi)毒素(LPS,美國Sigma 公司)；細(xì)胞因子IL-1β、 IL-4、IL-17檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；免疫組化抗體rabbit anti-NLRP-3(上海Abways公司), rabbit anti-caspase-1(美國Proteintech公司)，Elite ABC Kit(美國Vector 公司)；蛋白電泳(western blot)抗體NLRP-3(上海Abways公司)，caspase-1(美國Proteintech公司)，IL-1β抗體(英國Abcam公司)，多克隆兔抗β-actin抗體(美國Bioworld公司)。

1.1.3 主要藥物定喘湯(Dingchuantang，DCT)由南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院自制，根據(jù)《扶壽精方·痰門》制作定喘湯濃縮湯劑，處方組成：白果(去殼炒黃)9 g，麻黃9 g，紫蘇子6 g，甘草3 g，款冬花9 g，杏仁9 g，桑白皮9 g，黃芩6 g，法半夏9 g(飲片來源：南京鶴齡藥事服務(wù)有限公司)。按處方精確稱取藥材飲片，每次加水500 ml，浸泡30 min，煎煮1 h，煎煮2次，合并煎液，用8層紗布過濾湯液，濃縮至48 ml，配置成生藥，濃度為1.43 g/ml的母液，裝于無菌瓶中，存放至4 ℃冰箱，供小鼠灌胃給藥。按體表面積換算公式計(jì)算得定喘湯小鼠灌胃劑量為9 g/kg。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本實(shí)驗(yàn)采用2月齡BALB/c小鼠(雌雄不拘)48只，均由南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物飼養(yǎng)、管理及使用均嚴(yán)格按照《南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范》的要求進(jìn)行，動(dòng)物號SCXK(蘇)2016-0002。將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組，分別為哮喘治療組(OVA+DCT)，哮喘觀察組(OVA+NS)，定喘湯對照組(NS+DCT)，空白組(NS+NS)，每組12只。

1.2.2 建模及給藥OVA+DCT組及OVA+NS組小鼠在實(shí)驗(yàn)的第0、7天，用20 μg OVA溶于100 μl明礬佐劑腹腔注射，在第28、29、30天取100 μg LPS溶于40 μg生理鹽水滴鼻，第31～37天，5% OVA溶液(1 g OVA溶解于20 ml生理鹽水中)每日霧化吸入30 min，復(fù)制中性粒細(xì)胞為主的哮喘小鼠模型， NS+DCT組及NS+NS組同時(shí)間采用等量生理鹽水替代[5]。OVA+DCT組及NS+DCT組在第31天至第37天，采用定喘湯灌胃液1 ml灌胃(用9 ml定喘湯母液與20 ml生理鹽水混合，配置定喘湯灌胃液，用量為20 ml/kg，每只小鼠1 ml， 2 h內(nèi)分3次灌注，注意防嗆咳)，每天1次；OVA+NS組及NS+NS組小鼠以生理鹽水1 ml進(jìn)行灌胃。

1.2.3 BALF中IL-1β、IL-4、IL-17水平檢測末次灌胃結(jié)束24 h后，每組取6只動(dòng)物，采用3%戊巴比妥鈉(4 mg/100 g體質(zhì)量)麻醉固定后，采集肺泡灌洗液(BALF)，4 ℃，1500 r/min離心5 min，收集上清，采用ELISA試劑盒，具體步驟按檢測試劑盒說明書操作。在酶標(biāo)儀波長450 nm上讀取吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成相應(yīng)濃度，檢測BALF中IL-1β、IL-4、IL-17的表達(dá)。

1.2.4 肺組織NLRP3和caspase-1表達(dá)的免疫組化檢測另取每組6只動(dòng)物，取左肺中葉4%多聚甲醛固定、酒精梯度脫水、石蠟包埋切片(片厚5 μm)保存。采用ABC法：切片經(jīng)脫蠟、水化，煮沸法行抗原修復(fù)后，一抗rabbit anti-Caspase-1(1：200)；rabbit anti-NLRP3(1：200)4 ℃孵育過夜；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:200)室溫孵育1 h， 滴加Elite ABC混合液室溫孵育30 min，DAB底物室溫5 min顯色，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。鏡下觀察攝片，采用Image Pro Plus6.0半定量分析單位面積內(nèi)NLRP3及caspase-1的積分光密度(IOD)值[6]。

1.2.5 western blot檢測取左肺下葉稱重，20 mg加入100 μl蛋白裂解液在勻漿器中研磨(全程冰上操作)，13000 rpm，15 min,4 ℃離心。吸取上清，采用BCA方法進(jìn)行蛋白定量。進(jìn)行SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜5%脫脂奶中室溫封閉1 h。用封閉液稀釋好NLRP-3抗體(1∶1000)、Caspase-1抗體(1∶2000)和IL-1β抗體(1∶2000)封入薄膜中，室溫震搖過夜。PBST洗膜，10 min/次,3～4次。加入封閉液配制的二抗羊抗兔 (1∶2000)與膜一起封入薄膜中，室溫?fù)u床60 min。PBST洗膜，10 min/次,3～4次。現(xiàn)配顯影液，均勻?yàn)⒂谀ど?成像。采用灰度分析軟件Image Pro Plus 6.0軟件分析、計(jì)算各蛋白條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定性資料采用χ2檢驗(yàn)，半定量數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)，定量資料采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-4、IL-17比較BALF中，NS+NS組與NS+DCT組各炎癥因子無顯著差異。與NS+NS組相比，OVA+NS組與OVA+DCT組中IL-1β、IL-4和IL-17的表達(dá)均上升(P<0.05)。OVA+NS組與OVA+DCT組相比，OVA+DCT組中IL-1β(P<0.01)、IL-4(P<0.05)和IL-17(P<0.001)含量均顯著下降。見表1，圖1。

表1 肺泡灌洗液(BALF)中不同組動(dòng)物炎性因子的含量

圖1 肺泡灌洗液(BALF)中不同組動(dòng)物炎性因子的含量

2.2 各組小鼠肺組織免疫組化比較NLRP3及caspase-1結(jié)果顯示：NS+NS組與NS+DCT組小鼠氣道上皮基本完整，無明顯炎性因子浸潤，積分光密度值(IOD)組間無顯著差異(P>0.05，圖2A-D)。與NS+NS組相比，OVA+NS組與OVA+DCT組小鼠氣道上皮缺損，周圍可見炎性因子浸潤；2組NLRP3、caspase-1的IOD均顯著升高(P<0.001)，而相對較OVA+NS組,OVA+DCT組NLRP3的IOD顯著降低(P<0.01)，caspase-1的IOD也顯著降低(P<0.001)(圖2 A-D)。

注：A NLRP-3免疫組化；B caspase-1 免疫組化； C NLRP-3積分光密度值；D caspase-1積分光密度值圖2 不同組炎性小體相關(guān)指標(biāo)改變

2.3 各組小鼠肺組織內(nèi)NLRP-3、caspase-1、IL-1β及β-actin表達(dá)比較Western blot 結(jié)果顯示：與NS+NS組相比，OVA+NS組的IL-1β、NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)均上調(diào)；相較于OVA+NS組，OVA+DCT組中IL-1β、NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)均下調(diào)。見圖3。

圖3 IL-1β, NLRP-3, caspase-1的蛋白表達(dá)變化

3 討論

哮喘屬于中醫(yī)學(xué)“哮病”范疇。患者因先天稟賦不足、疾病遷延、體虛失養(yǎng)或接觸異物，致氣血津液失司，痰宿于肺。每外邪束肺，陽氣郁內(nèi)，易化痰熱，故應(yīng)祛邪宣肺，化痰清熱。定喘湯最早出自《扶壽精方·痰門》，治療熱哮效果顯著，后在不同地區(qū)不同時(shí)代醫(yī)家均有相似驗(yàn)方記載。定喘湯由白果、麻黃、紫蘇子、甘草、款冬花、杏仁、桑白皮、黃芩及半夏組成，此方集辛、澀、苦、甘四味，合宣、降、清三法[7]，邪去郁解，氣暢痰消。臨床研究表明定喘湯治療不同程度哮喘均有療效[2]，本課題組前期研究表明，定喘湯能降低Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子GATA-3，抑制Th2細(xì)胞亞群表達(dá)，從而扭轉(zhuǎn)Th1/Th2細(xì)胞亞群失衡[8]。傳統(tǒng)Th1/Th2平衡學(xué)說對哮喘機(jī)制解釋尚有不足，Th1/Th2失衡造成嗜酸性粒細(xì)胞聚集性哮喘，但對以中性粒細(xì)胞為主的重癥哮喘，難治性哮喘難以很好解釋。近期研究發(fā)現(xiàn)Th17也參與了哮喘發(fā)病過程， Th17/Th2失衡與中性粒細(xì)胞哮喘、重癥哮喘及難治性哮喘有密切聯(lián)系[9，10]。

正常生理?xiàng)l件下，NLRP3在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于自我抑制狀態(tài)，為出現(xiàn)可被識別的微生物結(jié)構(gòu)單元或病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子時(shí)，NLRP3能夠招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)和半胱天冬酶(caspase)-1組成的多蛋白復(fù)合物形成NLRP3炎癥小體?；罨难装Y小體可大量分泌IL-1β、IL-8及Caspase-1[11]。IL-1β可以與IL-6和趨化因子招募中性粒細(xì)胞，促進(jìn)Th17淋巴細(xì)胞分化，進(jìn)而增加IL-17，IL-22的分泌[12],在哮喘過程中起到重要作用，進(jìn)而提示NLRP3炎癥小體可能與哮喘病情嚴(yán)重程度正相關(guān)。

BALB/c小鼠具有遺傳基因單純，個(gè)體差異較小，價(jià)格較低，飼養(yǎng)場地適中，又有較好的炎癥、免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)[13]，OVA聯(lián)合LPS具備更強(qiáng)的免疫原性和抗原性，本研究采用OVA聯(lián)合LPS致敏BALB/c小鼠作為評價(jià)模型。OVA聯(lián)合LPS致敏的OVA+NS組及OVA+DCT組與NS+NS組及NS+DCT相比，小鼠肺組織炎性指數(shù)顯著上升，肺泡周圍出現(xiàn)大量炎性因子聚集，BLAF中IL-1β、IL-4、IL-17含量顯著上升，上述結(jié)果說明OVA-LPS-OVA小鼠造模成功，并且出現(xiàn)Th17/Th2失衡。定喘湯干預(yù)治療的OVA+DCT組BLAF中炎性因子IL-1β、NLRP3、caspase-1的蛋白表達(dá)較生理鹽水干預(yù)的OVA+DCT組均下降。同時(shí)，NS+NS組與NS+DCT組小鼠在BLAF中炎性因子水平、肺組織中蛋白水平均無顯著差異，表明定喘湯對于正常生理狀態(tài)下小鼠肺組織炎癥及相關(guān)因子無影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示定喘湯能抑制NLRP3炎癥小體，降低IL-1β、IL-17含量，減少炎性因子募集，減輕氣道及肺組織中炎癥反應(yīng)和提高抗炎作用，改善氣道結(jié)構(gòu)反應(yīng)，緩解哮喘癥狀。此外，定喘湯可以同步降低IL-4及IL-1β、IL-17的表達(dá)，改善Th1/Th2和Th2/Th17平衡，也從側(cè)面解釋了臨床應(yīng)用中定喘湯不論對于嗜酸性粒細(xì)胞哮喘還是中性粒細(xì)胞哮喘等輕、中、重度哮喘均有良好療效。

本研究主要集中探索成方“定喘湯”對于NLRP3炎癥小體及相關(guān)炎性因子在肺組織中的機(jī)制研究，此外，NLRP3炎癥小體異常激活的影響不局限于肺組織，常能引發(fā)或加重某些全身性疾病，例如2型糖尿病炎癥性腸病和阿爾茲海默病等[15]。后續(xù)研究中，我們繼續(xù)以中醫(yī)理論整體觀念為指導(dǎo)，如肺與大腸相表里等經(jīng)典論述出發(fā)，結(jié)合基礎(chǔ)科學(xué)研究，探討分析，擴(kuò)大定喘湯的治療適應(yīng)范圍，更好地體現(xiàn)中醫(yī)整體論治的特點(diǎn)。