金槍魚精巢魚精蛋白制備及活性評價

王 斌，楊繡榮，鄔華威,2，何 宇

金槍魚精巢魚精蛋白制備及活性評價

王 斌1，楊繡榮1，鄔華威1,2，何 宇1

（1. 浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，舟山 316004；2. 寧波今日食品有限公司，寧波 315502）

【】建立并優(yōu)化金槍魚精巢中魚精蛋白的制備方法，并研究其肝素拮抗效應(yīng)。通過單因素和響應(yīng)面試驗，優(yōu)化金槍魚魚精蛋白的提取工藝，采用羧甲基-瓊脂糖凝膠CL-6B（CM Sephaorse CL-6B）離子交換層析對金槍魚魚精蛋白粗品進(jìn)行純化，并通過坂口反應(yīng)、Tricine-十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳、氨基酸分析和肝素結(jié)合力-滴定法測定樣品純度和效價。確定金槍魚魚精蛋白的提取最佳工藝條件為提取溫度36 ℃、硫酸濃度0.4 mol/L、液料比為6∶1、提取時間65 min，在此條件下得率為12.51% ± 1.2%。采用CM Sephaorse CL-6B離子交換層析對金槍魚魚精蛋白粗品進(jìn)行純化，獲得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個組分。坂口反應(yīng)顯示組分Ⅲ呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，Tricine-SDS-PAGE電泳表明其分子質(zhì)量為6.5~21.1 ku，氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為76.90% ± 0.37%，堿性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.00% ± 0.27%，精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25.86% ± 0.32%，肝素結(jié)合力-滴定法測定結(jié)果顯示組分Ⅲ的效價約為標(biāo)品魚精蛋白的2/3。以上結(jié)果證明組分Ⅲ為目標(biāo)蛋白，即金槍魚魚精蛋白。

金槍魚；精巢；魚精蛋白；活性

金槍魚廣泛分布于熱帶和溫帶水域，年捕獲量超過600萬t，占公海漁業(yè)總產(chǎn)量70%以上，是世界遠(yuǎn)洋漁業(yè)的重要作業(yè)魚種之一[1-2]。商業(yè)金槍魚品種主要包括藍(lán)鰭金槍魚（）、黃鰭金槍魚（）、鰹（）、長鰭金槍魚（）、大眼金槍魚（）和馬蘇金槍魚（）6種[3]。

金槍魚是水產(chǎn)類罐頭生產(chǎn)的重要原料，在國際罐頭貿(mào)易中扮演重要角色[3]。鰹魚占金槍魚總捕獲量的58%，在加工成罐頭過程中，產(chǎn)生魚骨、魚皮、內(nèi)臟等超過魚體總質(zhì)量50%的下腳料，主要用于生產(chǎn)魚粉、寵物食品和魚飼料等，未充分體現(xiàn)出金槍魚的經(jīng)濟(jì)價值[4-7]。研究表明金槍魚下腳料中富含有大量活性蛋白、磷脂、不飽和脂肪酸和鈣質(zhì)等活性物質(zhì)[8]，是制備膠原蛋白、魚油、磷脂和活性肽的優(yōu)質(zhì)原料[9-12]。

精巢組織是金槍魚加工下腳料的主要組成之一，約占魚體質(zhì)量的7%[13]。精巢組織中含有的堿性蛋白——魚精蛋白，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域經(jīng)常被用來作為肝素拮抗劑和注射胰島素的載體，在食品加工過程中主要被用作天然防腐劑，具有較高經(jīng)濟(jì)價值[13]。但是，利用金槍魚精巢制備魚精蛋白的研究尚未見報道。因此，本研究在測定金槍魚魚精營養(yǎng)成分基礎(chǔ)上，建立了魚精蛋白的制備工藝，為金槍魚精巢的高效利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

冷凍金槍魚（）解凍，切割，取出精巢，-20 ℃冰凍24 h，裝于密封泡沫盒，4 h內(nèi)運(yùn)至試驗室，-20 ℃儲存。試驗前，樣品解凍，除雜，純水洗滌，瀝干，部分樣品37 ℃恒溫干燥箱烘至恒重，研磨成粉末，測定常規(guī)營養(yǎng)成分。

1.2 試驗方法

1.2.1 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定方法 粗蛋白、脂肪和灰分分別參照GB 5009.5-2016、GB 5009.6-2016和5009.4-2016方法進(jìn)行測定[14]，核酸含量采用定磷法測定[15]。

1.2.2 氨基酸組成與含量測定 參照王繼隆等[16]方法測定樣品氨基酸組成與含量。

1.2.3 魚精蛋白提取 參考劉燕妮[13]方法提取金槍魚精巢魚精蛋白。金槍魚精巢室溫解凍、勻漿后，用4倍體積的乙酸乙酯浸泡，間歇性攪拌24 h后，過濾烘干，最后粉碎。稱取10 g金槍魚精巢粉末，置于100 mL燒杯中，加入100 mL 0.14 mol/L NaCl溶液，均質(zhì)勻漿1 min，于0 ℃下攪拌20 min，靜置10 min后，4 000 r/min低溫離心10 min，棄去上清液。在沉淀物中，按設(shè)計的硫酸濃度、提取溫度、液料比和提取時間進(jìn)行試驗，提取液于4 000 r/min低溫離心10 min，上清液用3倍體積的4 ℃、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，冰浴下靜置30 min，于0 ℃、4 000 r/min離心15 min，取沉淀用丙酮洗滌2次，冷凍干燥，得魚精蛋白粗品。用考馬斯亮藍(lán)G250染色法測定蛋白含量，魚精蛋白得率計算公式如下：

魚精蛋白得率 = 蛋白含量/精巢重量 × 100%

1.2.3.1 單因素試驗優(yōu)化魚精蛋白提取工藝 硫酸濃度對魚精蛋白得率的影響：在液料比（mL/g）3∶1、溫度0 ℃、提取時間1 h的條件下，考察硫酸濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L）對魚精蛋白得率的影響。

液料比對魚精蛋白得率的影響：在硫酸濃度為0.4 mol/L、溫度0 ℃、提取時間1 h的條件下，考察液料比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）對魚精蛋白得率的影響。

提取時間對魚精蛋白得率的影響：在硫酸濃度為0.4 mol/L、浸提溫度0 ℃、液料比6∶1的條件下提取，考察提取時間（10、15、30、60、90、120 min）對魚精蛋白得率的影響。

提取溫度對魚精蛋白得率的影響：在硫酸濃度為0.4 mol/L、液料比6∶1、提取時間30 min的條件下提取，考察提取溫度（0、15、25、35、45、55、60 ℃）對魚精蛋白得率的影響。

1.2.3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化魚精蛋白提取工藝 在單因素試驗得到的優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design Expert 8.0.6.1軟件按照Box-Behnken原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計（表1），優(yōu)化魚精蛋白提取工藝。

表1 Box-Behnken 設(shè)計的因素編碼和水平

1.2.4 魚精蛋白的純化 將100 mL羧甲基-瓊脂糖凝膠CL-6B（CM Sephaorse CL-6B）搖勻，后倒入250 mL燒杯中，加100 mL超純水，攪拌均勻，抽濾去除液體，加200 mL 0.5 mol/L NaOH溶液，浸泡30 min，抽濾去除液體，用純水洗至中性。將預(yù)處理過的CM Sephaorse CL-6B裝入層析柱（直徑 1.0 cm，高30 cm）至柱體積約30 mL。用25 mmol/L CH3COOH-CH3COONa緩沖液平衡3個柱體積。取2 mL 20 mg/mL魚精蛋白溶液注入層析柱，220 nm檢測，流速為2 mL/min，CH3COOH- CH3COONa緩沖液洗至檢測儀記錄線回到基線后，按照4 mL/管收集，共收集27管。對其以0.8~2.0 mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫（1 ~ 7號管，0.8 mol/L; 8 ~ 16號管，1.0 mol/L; 17 ~ 27號管，2.0 mol/L），按色譜峰合并樣品，透析24 h脫鹽，凍干、備用。實驗重復(fù)3次，計算各色譜峰樣品的得率。

1.2.4 金槍魚魚精蛋白粗品鑒定

1.2.4.1 Tricine-SDS-PAGE電泳 參考?xì)v朝龍等[17]的方法進(jìn)行Tricine-SDS- PAGE電泳試驗。配制體積分?jǐn)?shù)18%分離膠和5%濃縮膠，100 V電泳60 min，用考馬司亮藍(lán)R-250染色液染色15 min后，脫色液脫色并拍照。

1.2.4.2 坂口反應(yīng)試驗 參考翁連進(jìn)等[18]的方法進(jìn)行坂口反應(yīng)試驗。取1 mL 1 mg/mL的樣品溶液于試管中，依次加入0.5 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaOH、100 μL 體積分?jǐn)?shù)0.2% α-萘酚乙醇溶液、50 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% NaClO溶液，振蕩，觀察溶液顏色，顯紅色為陽性反應(yīng)。

1.2.4.3 肝素結(jié)合力-滴定法測定魚精蛋白效價 參考郭玉東等[19]的方法進(jìn)行肝素結(jié)合力-滴定試驗方法。稱取測定樣品3份，用無菌水配制成0.05、0.10和0.15 mg/mL 3個質(zhì)量濃度的待測液。取2 mL待測液，置于比色皿內(nèi)并滴加肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于500 nm處測定吸光度值，加入一定體積90 U/mL肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液，直至比色皿種吸光度值陡增，停止滴加。記錄滴定的肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液總體積，并按下列公式計算1 mg樣品中和肝素的效價（U/mg）：

樣品效價=t× 90 /（s×s）

其中，t表示滴定的肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液總體積；s表示待測液體積；s表示測定樣品的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 金槍魚精巢常規(guī)營養(yǎng)成分分析

金槍魚精巢營養(yǎng)成分測定結(jié)果如表2所示：粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為52.71% ± 0.42%，其次是核酸（27.59% ± 0.43%）、粗脂肪（10.36% ± 0.79%）和灰分（3.34% ± 0.14%）。

表2 金槍魚卵巢常規(guī)營養(yǎng)成分（n = 3）

2.2 金槍魚魚精蛋白的提取工藝研究

2.2.1 單因素試驗結(jié)果分析 圖1（A）表明：隨著硫酸濃度的提高，魚精蛋白提取率逐漸升高，到達(dá)0.4 mol/L時，蛋白得率最大（< 0.05）；而后，隨著硫酸濃度增大，魚精蛋白的結(jié)構(gòu)破壞逐漸增強(qiáng)，得率開始下降。因此，最優(yōu)硫酸摩爾濃度值為0.4 mol/L。

由圖1（B）表明：魚精蛋白提取率隨液料比的增加而逐漸提高，6∶1時達(dá)到最大（< 0.05）。故確定最佳液料比為6∶1。

由圖1（C）表明：魚精蛋白提取率隨時間延長而逐漸提高，1 h時提取率最高（> 0.05）。而后，由于時間延長，硫酸對魚精蛋白的破壞作用增強(qiáng)，提取率略有下降。因此，選擇最佳提取時間為1 h。

由圖1（D）表明：溫度對魚精蛋白得率有一定影響，溫度過低使得魚精蛋白提取不充分，而溫度過高造成硫酸對魚精蛋白的破壞作用增強(qiáng)[15]。因此，最佳提取溫度為35 ℃。

A，硫酸濃度；B，液料比；C，提取時間；D，溫度

2.2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.2.2.1 響應(yīng)面二次模型方差及顯著性分析 在單因素試驗基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面設(shè)計考察硫酸濃度（）、液料比（）、提取溫度（）、提取時間（）4個因素對魚精蛋白得率的影響，結(jié)果如表3所示。用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立魚精蛋白得率的回歸方程為：魚精蛋白得率= 13.676 + 0.17- 0.14+ 0.31+ 0.5+ 0.61- 0.12- 0.19- 0.57+ 0.12+ 0.14- 2.042- 1.192- 1.222- 1.132。

表3 Box-Benhnken試驗設(shè)計及結(jié)果

如表4所示，在二次多元回歸擬合方程的方差分析中，模型值< 0.000 1，說明此模型極顯著；失擬項值為0.345 2 > 0.05，方程2為0.975 1，模型的變異系數(shù)CV為2.50%，信噪比為20.296且大于4，表明模型方程擬合度較好，該模型可用于蛋白得率預(yù)測。二次多元擬合模型的校正決定系數(shù)adj2等于0.950 3，表明約有95.03%的魚精蛋白得率的變化可由此模型進(jìn)行解釋。、、、、2、2、2和2項為顯著影響因素（< 0.05）；各因素的值大小反映了其對試驗響應(yīng)值影響的重要性，值越大則影響越大。因此，魚精蛋白得率受各因素影響程度大小為：提取溫度＞提取時間＞硫酸濃度＞液料比。

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析

注：**和*分別表示差異極顯著（< 0.01）和顯著（< 0.05）

Notes：** and * indicate the differences are very significant (< 0.01) and significant (< 0.05), respectively

2.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化3D曲面圖分析 通過響應(yīng)面曲面圖（圖2）和等高線分析可以反映出兩兩因素交互作用，等高線的形狀越接近于橢圓形，則兩個因素交互作用越顯著；反之，等高線的形狀越接近于圓形，則兩個因素交互作用越不顯著；響應(yīng)面曲面圖為凸型，則說明蛋白得率存在極大值。圖2結(jié)果表明：硫酸濃度（）和液料比（）、液料比（）和提取溫度（）之間的兩兩交互作用對魚精蛋白得率的影響顯著；硫酸濃度（）與提取溫度（）、硫酸濃度（）和提取時間（）、液料比（）和提取時間（）、提取溫度（）和提取時間（）的交互作用不顯著。該結(jié)果與表3結(jié)果相一致。

2.3.3 驗證 響應(yīng)面模型最后預(yù)測出的最優(yōu)條件：提取時間為65.35 min、液料比為6.08∶1、硫酸濃度為0.42 mol/L、溫度為36.59 ℃、蛋白得率13.12。結(jié)合實際操作，改為提取時間65 min、液料比6∶1、硫酸濃度0.42 mol/L、溫度36 ℃。3次平行試驗結(jié)果為12.51% ± 1.2%，與預(yù)測結(jié)果較接近，證明該模型可以較好地預(yù)測魚精蛋白的得率。

2.4 CM Sephaorse CL-6B離子交換層析分離

從圖3可以看出，金槍魚魚精蛋白粗品經(jīng)過CM Sephaorse CL-6B分離得到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共3個峰，得率分別為25.12%，34.26%和27.37%。

2.5 金槍魚魚精的鑒定與組成分析

魚精蛋白含有豐富的精氨酸，堿性條件下精氨酸的胍基與次氯酸鈉及α-萘酚形成紅色物質(zhì)，即坂口反應(yīng)呈陽性。圖4結(jié)果表明：0.1%精氨酸（圖4A）、金槍魚魚精蛋白粗品（圖4B）和組分Ⅲ（圖4E）顯示紅色，具有顯著的陽性反應(yīng)。Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果（圖5）表明：魚精蛋白組分Ⅲ有多個組分構(gòu)成，分子質(zhì)量處于6.5 ~ 21.1 ku之間。已有研究表明魚精蛋白并非由單一組分構(gòu)成，如虹鱒（）魚精蛋白由6種差別極小的成分組成[20]，而鯖（）魚精蛋白由Ⅰ和Ⅱ兩個組分組成，且組分Ⅰ中還包含3個成分[21]。圖5結(jié)果表明：金槍魚魚精蛋白的組分要多于虹鱒和鯖，但具體結(jié)果組成需要更加細(xì)致的分析和鑒定方法進(jìn)行確定。

圖3 金槍魚魚精蛋白粗品經(jīng)CM Sephaorse CL-6B離子交換層析

（A）0.1%精氨酸；（B）魚精蛋白粗品；（C）組分I；（D）組分II；（E）組分III。

圖5 純化后金槍魚魚精蛋白Tricine-SDS-PAGE電泳圖譜

經(jīng)測定，金槍魚魚精蛋白組分III蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為77.63% ± 1.2%。為更加細(xì)致分析金槍魚魚精蛋白的性質(zhì)，本實驗對其氨基酸組成與含量進(jìn)行了測定（表5），結(jié)果表明：組分III氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為76.90% ± 0.37%，堿性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.99% ± 0.27%，約占所測氨基酸總量的1/3，主要包括精氨酸、賴氨酸、組氨酸3種堿性氨基酸，其分別占總氨基酸的25.86% ± 0.32%、11.30% ± 0.19%和1.83% ± 0.11%。金槍魚魚精蛋白組分III的堿性氨基酸含量與鯉（）[22]和鰱（）[23]魚精蛋白相當(dāng)，但低于鮭（）[24]魚精蛋白精氨酸含量。

表5 金槍魚魚精蛋白組分III的氨基酸組成

2.6 金槍魚魚精蛋白拮抗肝素作用分析

魚精蛋白中的陽離子精氨酸基團(tuán)和肝素中的陰離子基團(tuán)通過1∶1的靜電結(jié)合，在數(shù)秒內(nèi)形成清晰可見的白色懸浮的中性魚精蛋白-肝素鹽聚合體，使抗凝血酶-肝素復(fù)合物分離，恢復(fù)原有的抗凝血酶活性[25]。肝素結(jié)合力-滴定法測定硫酸魚精蛋白生物活性被各國藥典廣泛采用，其操作簡單，試驗誤差小[26]。滴定結(jié)果表明：組分Ⅲ和對照品（標(biāo)品）溶液均出現(xiàn)了不透明的白色渾濁物質(zhì)，而組分Ⅰ和Ⅱ溶液未見明顯白色懸浮顆粒。表6結(jié)果表明：組分Ⅲ的效價約為是對照品的2/3，而組分Ⅰ和Ⅱ并未與肝素結(jié)合。因此，結(jié)合坂口反應(yīng)、Tricine-SDS-PAGE、氨基酸分析和肝素結(jié)合力-滴定結(jié)果，確定組分Ⅲ為金槍魚魚精蛋白。

魚精蛋白藥物（即硫酸鹽魚精蛋白）在逆轉(zhuǎn)低分子肝素活性方面具有顯著效果，被用作手術(shù)后肝素抗凝血活性的拮抗劑。金槍魚加工過程中每年將產(chǎn)生數(shù)十萬噸的精巢組織，尚未被有效利用。因此，以金槍魚精巢為原料，開發(fā)魚精蛋白藥物，將顯著增加金槍魚精巢的附加值。

表6 肝素結(jié)合力-滴定法測定金槍魚魚精蛋白效價

注：上標(biāo)字母相同表示無顯著性差異（> 0.05）

Notes：Values with same superscripts indicate no significant difference (> 0.05)

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面試驗確定金槍魚魚精蛋白的提取工藝最佳條件為：溫度36 ℃、硫酸濃度0.4 mol/L、液料比6∶1、時間65 min。在此條件下，金槍魚魚精蛋白的得率最高，為12.51%±1.2%。魚精蛋白粗品經(jīng)CM Sephaorse CL-6B離子交換層析純化，通過坂口反應(yīng)、Tricine-SDS-PAGE電泳、氨基酸分析和肝素結(jié)合力-滴定試驗，確定組分Ⅲ為金槍魚魚精蛋白，其分子質(zhì)量為6.5 ~ 21.1 ku，堿性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為38.99%±0.27%，精氨酸占總氨基酸的25.86%±0.32%，其與肝素結(jié)合的效價約為對照品（標(biāo)品）的2/3。

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Preparation and Heparin Antagonistic Effect of Protamine from Skipjack Tuna () Milts

WANG Bin1, YANG Xiu-Rong1, WU Hua-Wei1,2, HE Yu1

（1.,,316004,; 2..,.,315502,）

【】To establish an extraction method of protamine from skipjack tuna () milts and to determine the antagonistic effect of protamine to heparin. 【】The extraction process of tuna protamine was optimized by a single factor and response surface methodology. The crude protamine was purified by CM Sephaorse CL-6B ion exchange chromatography with the Sakaguchi detection methods. Tricine-SDS-PAGE, amino acid analysis and heparin titration. 【】The optimum extraction conditions of tuna protamine were the temperature of 36 ℃, H2SO4concentration of 0.4 mol/L, liquid-to-solid ratio of 6∶1, and extraction time of 65 min. Under the optimum conditions, the yield of crude protamine was 12.51% ±1.2%. The crude protamine was fractionated into three components (I, II and III) by CM Sephaorse CL-6B column. Components III showed the positive reaction in Sakaguchi reaction, and its molecular weight was measured using Tricine-SDS-PAGE and ranged from 6.5 to 21.1 ku. Amino acid analysis indicated that the contents of total amino acids, alkaline amino acids and arginine were 76.90% ± 0.37%, 39.00% ± 0.27% and 25.86% ± 0.32%. Results from heparin binding force - titration assay indicated that component III was approximately two-thirds of standard protamine. Therefore, component Ⅲ was confirmed to be tuna protamine.

Skipjack tuna (); milt; protamine; activity

R151.3

A

1673-9159（2020）05-0064-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.05.008

2020-04-09

國家自然科學(xué)基金（81673349）；舟山市科技專項（2019c21015）

王斌（1977－），男，教授，研究方向為海洋生物資源綜合利用。E-mail：wangbin4159@hotmail.com

王斌，楊繡榮，鄔華威，等. 金槍魚精巢魚精蛋白制備及活性評價[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2020，40（5）：64-71.

（責(zé)任編輯：劉朏）