廣東紫珠提取物對母豬繁殖性能、免疫、抗氧化功能及腸道微生物的影響

陳小連，宋文靜，周泉勇，宋瓊莉，鄒志恒，劉林秀，胡利珍，韋啟鵬*，嚴景生，達列亞·阿合買提

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，南昌330200；2.江西省井岡山市畜牧獸醫(yī)局，江西 井岡山343604；3.新疆維吾爾自治區(qū)獸藥飼料監(jiān)察所，烏魯木齊830063）

廣東紫珠（Callicarpa kwangtungensisChun.），別名紫珠草，是馬鞭草科紫珠屬落葉灌木，主要分布在江西、湖南、湖北、廣東、廣西等地[1]，2010 年被納入中國藥典，臨床主要用于治療宮頸炎、盆腔炎與陰道炎等婦科炎癥，療效顯著，是“抗宮炎片”“抗宮炎膠囊”等中成藥的主要原料[1-2]。廣東紫珠富含苯乙醇苷類（如連翹酯苷B和金石蠶苷）、黃酮類、萜類和酚酸類等活性成分[3-6]，其中苯乙醇苷類和黃酮類具有顯著的抑菌、抗炎、抗氧化、增強免疫力等功效[3,6-8]。目前，廣東紫珠在人醫(yī)臨床上已廣泛應(yīng)用，在獸醫(yī)臨床上的應(yīng)用也取得顯著成效。魏運銻[9]報道了利用紫珠草成功治愈牛頑固性衄血、牛血痢、母牛產(chǎn)后血崩、豬惡毒腫痛等病例?？子岬萚10]利用含紫珠草浸膏、益母草浸膏等組方的飼糧飼喂臨產(chǎn)母豬5～6 d，母豬產(chǎn)后“三聯(lián)癥”的發(fā)病率和仔豬黃白痢發(fā)病率均較對照組低，斷奶仔豬頭數(shù)和斷奶平均窩體質(zhì)量顯著高于對照組；王勝萍等[11]在產(chǎn)后母豬基礎(chǔ)日糧中添加紫珠浸膏粉7 d，也得到類似結(jié)果。隨著抗生素在飼料中的全面禁用，在母豬飼糧中使用無公害、無殘留、無耐藥性的綠色飼料添加劑替代飼用抗生素已成為國內(nèi)外研究的熱點。廣東紫珠提取物屬純天然物質(zhì)，作為綠色飼料添加劑在母豬生產(chǎn)上還鮮有報道。而深入開展廣東紫珠提取物作用于母豬抑菌、抗炎和抗氧功能的有效成分及作用機制研究，對減少抗生素等藥物使用、研制抗生素替代品和大力發(fā)展生態(tài)健康養(yǎng)殖具有重要而深遠的意義。本文研究了在妊娠和哺乳母豬飼糧中添加廣東紫珠提取物對母豬免疫力、繁殖性能、抗氧化功能和腸道微生物的影響，旨在為廣東紫珠在養(yǎng)豬生產(chǎn)上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用廣東紫珠提取物購于湖南華康生物科技股份有限公司，為棕黃色粉末，帶有特殊氣味，含連翹酯苷B 20 mg/kg，金石蠶苷15 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選取體質(zhì)量、胎次（3～5胎）和預(yù)產(chǎn)期相近的健康妊娠母豬50 頭，隨機分成5 組，每組5 個重復(fù)，每個重復(fù)2 頭母豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組分別飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加50、100、150和200 mg/kg廣東紫珠提取物的飼糧，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗期從母豬妊娠第30 天開始至分娩后第25天結(jié)束。妊娠期試驗?zāi)肛i在妊娠舍定位欄內(nèi)飼喂，飼喂量控制在2.0～3.5 kg/d 之間，自由飲水。產(chǎn)前第3天轉(zhuǎn)入產(chǎn)房，限制飼喂。分娩當(dāng)天不飼喂，分娩后第1天飼喂1 kg飼糧，隨后每天增加1 kg，直到自由采食。試驗豬均嚴格按照豬場常規(guī)管理程序及免疫程序進行管理。

1.3 樣品采集

1.3.1 母豬血液采集

分別在母豬妊娠第60 天、分娩當(dāng)天、仔豬斷奶當(dāng)天，于早晨飼喂前，從耳緣靜脈采血4～5 mL到離心管中，靜置10 min 后離心，將血清分裝于1.5 mL EP（Eppendorf）管中，于-20 ℃條件下冷凍，待測。

1.3.2 母豬糞便采集

于試驗結(jié)束當(dāng)天07：00—08：00，在每個重復(fù)中采集1 頭母豬的新鮮糞便，放入無菌封口袋中，置于-80 ℃冰箱中保存，待測。

1.4 指標測定

1.4.1 母豬繁殖性能

母豬分娩時，記錄母豬總產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活健仔數(shù)（初生體質(zhì)量≥0.8 kg），稱量仔豬個體體質(zhì)量，計算健仔初生平均體質(zhì)量和初生窩體質(zhì)量。仔豬于25 日齡斷奶，記錄斷奶仔豬數(shù)，稱量每頭斷奶仔豬體質(zhì)量，計算斷奶平均體質(zhì)量和斷奶窩體質(zhì)量。

1.4.2 母豬血清抗氧化性能指標

采用黃嘌呤氧化酶法測定血清總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性，采用比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活性，采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量。具體操作參照試劑盒（購自南京建成生物工程研究所）說明書進行。

1.4.3 母豬血清炎癥因子水平

采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法檢測血清炎癥因子白細胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）、白細胞介素6（interleukin-6, IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factor-α,TNF-α）水平。具體操作嚴格按照試劑盒（購自武漢云克隆科技股份有限公司）說明書進行。

1.4.4 母豬糞便微生物數(shù)量

使用糞便基因組DNA提取試劑盒[購自天根生化科技（北京）有限公司]提取糞便微生物總DNA。根據(jù)文獻報道的引物序列，分別合成真細菌[12]、大腸埃希菌[12]、乳桿菌屬[13]、雙歧桿菌屬[14]、產(chǎn)氣莢膜梭菌[15]、擬桿菌屬[16]的引物，采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）方法測定糞便微生物數(shù)量；以真細菌16S rDNA 為看家基因[12]，采用2-△△CT法計算各微生物相對數(shù)量。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient level of basal diets(air-dry basis)

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

用Excel 2013 軟件對數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和鄧肯多重比較，對顯著性指標進行二次曲線回歸分析。結(jié)果用平均值±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 廣東紫珠提取物對母豬繁殖性能的影響

由表2 可見，母豬日糧中添加不同水平廣東紫珠提取物對母豬繁殖性能有顯著影響。與對照組相比，添加不同水平廣東紫珠提取物對窩總產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)及產(chǎn)活仔率均無顯著影響（P＞0.05），但使窩總產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)及產(chǎn)活仔率均有不同程度的提高。50和100 mg/kg組仔豬初生體質(zhì)量及100 和150 mg/kg 組初生窩體質(zhì)量均顯著高于對照組（P＜0.05）。150 mg/kg組仔豬斷奶體質(zhì)量及斷奶窩體質(zhì)量均顯著高于對照組（P＜0.05），而其他各組與對照組差異不顯著（P＞0.05）。回歸分析表明：仔豬初生窩體質(zhì)量與廣東紫珠提取物添加水平呈顯著的二次曲線回歸關(guān)系（P=0.035），回歸方程為y=-0.000 3x2+0.072 4x+14.586（R2=0.965 1），方程的常數(shù)項、一次項和二次項系數(shù)均達顯著水平（P＜0.05）；當(dāng)廣東紫珠提取物添加量為121 mg/kg時，仔豬初生窩體質(zhì)量達到最大。

2.2 廣東紫珠提取物對母豬血清抗氧化水平的影響

由表3 可見，母豬日糧中添加廣東紫珠提取物顯著影響母豬血清SOD 活性和MDA 水平，而對GSH-Px 活性無顯著影響（P＞0.05）。在孕中期，添加廣東紫珠提取物各組SOD 水平均顯著高于對照組（P＜0.05），添加100 mg/kg 及以上水平廣東紫珠提取物顯著降低血清MDA 水平（P＜0.05）。回歸分析表明：孕中期血清SOD 活性與廣東紫珠提取物添加水平呈顯著二次曲線回歸關(guān)系（P=0.039），得到方程y=-0.001x2+0.294x+78.786（R2=0.922）；當(dāng)廣東紫珠提取物添加量為161 mg/kg 時，血清SOD 活性達到最高。在分娩當(dāng)天，200 mg/kg廣東紫珠提取物組SOD活性最高，且顯著高于對照組（P＜0.05）；添加廣東紫珠提取物顯著降低血清MDA 水平（P＜0.05）。通過回歸分析發(fā)現(xiàn)：分娩時母豬血清MDA含量隨廣東紫珠提取物添加水平升高呈先降后升的二次曲線回歸關(guān)系（P=0.000 1），回歸方程為y=0.000 1x2-0.031x+7.367（R2=0.999 6）；當(dāng)廣東紫珠提取物添加量為126 mg/kg 時，MDA 含量最低。在仔豬斷奶當(dāng)天，與對照組相比，添加廣東紫珠提取物顯著提高母豬血清SOD 活性（P＜0.05），當(dāng)添加到100 mg/kg 及以上水平時，血清MDA含量顯著降低（P＜0.05）。

表2 廣東紫珠提取物對母豬繁殖性能的影響Table 2 Effects of C.kwangtungensis extract on reproductive performance of sows

表3 廣東紫珠提取物對母豬血清抗氧化水平的影響Table 3 Effect of C.kwangtungensis extract on serum antioxidant capacity of sows

2.3 廣東紫珠提取物對母豬促炎因子的影響

由表4 可見，廣東紫珠提取物對母豬產(chǎn)后炎癥具有一定的緩解作用。在孕中期，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平隨著廣東紫珠提取物添加量的升高而降低，其中：200 mg/kg組IL-1β水平與對照組相比差異達顯著水平（P＜0.05），150 和200 mg/kg 組IL-6水平均顯著低于對照組（P＜0.05），廣東紫珠提取物各組TNF-α水平均顯著低于對照組（P＜0.05）。分娩當(dāng)天，廣東紫珠提取物各組IL-1β、IL-6 及TNF-α水平均顯著低于對照組（P＜0.05），且IL-1β和TNF-α水平隨廣東紫珠提取物添加量的升高呈顯著的二次曲線變化，其中：IL-1β的回歸方程為y=0.000 2x2-0.071 7x+12.675（R2=0.970 2，P=0.030），TNF-α的回歸方程為y=0.002 3x2-0.771x+157.08（R2=0.992，P=0.008）。由此推算，當(dāng)廣東紫珠提取物 添 加 量 分 別 為164 和165 mg/kg 時，IL-1β和TNF-α水平分別達到最低。在斷奶當(dāng)天，150 和200 mg/kg 組IL-1β和IL-6 水平均顯著低于對照組（P＜0.05），而廣東紫珠提取物各組TNF-α水平均顯著低于對照組（P＜0.05）。

表4 廣東紫珠提取物對母豬促炎因子的影響Table 4 Effect of C.kwangtungensis extract on inflammatory factors of sows pg/mL

2.4 廣東紫珠提取物對母豬腸道菌群的影響

由圖1 可見，母豬日糧中添加不同水平廣東紫珠提取物對腸道微生物菌群有顯著影響。與對照組相比，添加50 mg/kg及以上的廣東紫珠提取物顯著增加了乳桿菌屬和雙歧桿菌屬細菌數(shù)量（P＜0.05）；添加100 mg/kg 及以上的廣東紫珠提取物顯著降低了大腸埃希菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量（P＜0.05）；添加150 和200 mg/kg 的廣東紫珠提取物可顯著增加擬桿菌屬細菌數(shù)量（P＜0.05）。

3 討論

隨著現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)的集約化、規(guī)?；l(fā)展，母豬長期處于高負荷生產(chǎn)狀況下，極易出現(xiàn)免疫力和生產(chǎn)性能下降、繁殖障礙性疾病等問題，限制了養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展。為突破這一瓶頸，大量的抗生素和化學(xué)合成藥物被應(yīng)用于母豬的保健、疾病預(yù)防與治療、母豬的繁殖性能提高等方面[17]，但隨之而來的動物免疫力下降、耐藥性及藥物殘留等負面效應(yīng)嚴重威脅著畜禽產(chǎn)品安全和人類健康。植物提取物因富含多種生物活性成分且具備天然、綠色、無耐藥性及藥物殘留等特點，成為最具前景的抗生素替代物之一[18]。研究證明，植物提取物在提高母豬生產(chǎn)性能、免疫功能、抗氧化性能及維持腸道微生物穩(wěn)態(tài)方面有顯著作用[19]。

3.1 廣東紫珠提取物對改善母豬繁殖性能的作用

母豬總產(chǎn)仔數(shù)、活仔率及活仔的初生體質(zhì)量、初生窩體質(zhì)量、斷奶體質(zhì)量和斷奶窩體質(zhì)量等是衡量母豬繁殖性能的重要指標，也是保證仔豬斷奶后保持較高生產(chǎn)性能的前提條件[20-21]。植物提取物含有較多生物活性物質(zhì)，可通過不同的作用途徑影響母豬生產(chǎn)性能。杜莉等[22]報道，在母豬飼糧中添加40 mg/kg 博落回提取物，可顯著提高仔豬初生平均體質(zhì)量和初生窩體質(zhì)量。曾丹等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在母豬飼糧中添加0.1%黨參提取物，可顯著提高仔豬初生體質(zhì)量。本實驗中，在母豬妊娠期和泌乳期添加廣東紫珠提取物可提高仔豬的初生體質(zhì)量、初生窩體質(zhì)量、斷奶體質(zhì)量和斷奶窩體質(zhì)量。由于各組間仔豬數(shù)量不具有顯著差異，因此初生窩體質(zhì)量和斷奶窩體質(zhì)量的增加主要是仔豬個體體質(zhì)量顯著增加的結(jié)果，說明在母豬飼料中添加廣東紫珠提取物可以在一定程度上提高母豬繁殖性能和仔豬生長性能。這可能是由于廣東紫珠提取物中的苯乙醇苷類和黃酮類等活性成分發(fā)揮抑菌抗炎和抗氧化作用，通過改善母豬免疫功能和抗氧化功能及腸道菌群平衡等綜合效果來提高母豬健康狀況，從而促進了仔豬胚胎期和出生后的發(fā)育。

圖1 廣東紫珠提取物對母豬腸道菌群的影響Fig.1 Effect of C.kwangtungensis extract on intestinal flora of sows

3.2 廣東紫珠提取物對提高母豬抗氧化能力的作用

母豬在妊娠、分娩和泌乳階段，其生理狀態(tài)和體內(nèi)代謝會發(fā)生一系列變化，這將會導(dǎo)致內(nèi)源性自由基大量增加[24]，抗氧化和免疫功能大幅下降，進而影響母豬的生產(chǎn)性能和哺乳仔豬的健康水平。SOD 和GSH-Px 活性的高低間接反映了機體清除自由基能力的強弱，MDA 可間接反映組織脂質(zhì)過氧化物損傷程度[25]。本試驗中，廣東紫珠提取物可以顯著提高母豬妊娠、分娩和哺乳階段SOD 活性，顯著降低各階段MDA含量。這提示廣東紫珠提取物具有較強的抗氧化活性，可提高繁殖母豬機體清除自由基能力，并有效緩解繁殖母豬的氧化應(yīng)激。這是由于廣東紫珠提取物中富含的苯乙醇苷類、黃酮類和酚類物質(zhì)具有顯著的抗氧化活性。CAI 等[6]通過采用清除1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、2，2-聯(lián)氮-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS＋·）、超氧陰離子，以及Cu2＋螯合法、抗脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等研究發(fā)現(xiàn)，廣東紫珠提取物具有較強的抗氧化活性，其含有的抗氧化物質(zhì)至少由9種苯乙醇苷類如連翹酯苷B、金石蠶苷、毛蕊花糖苷等和1 種黃酮類（鼠李秦素）物質(zhì)組成；連翹酯苷苯環(huán)上的酚羥基鄰位的羥基有很強的抗氧化和自由基清除能力，可以有效保護細胞和機體免受自由基誘導(dǎo)的損傷[26]。

3.3 廣東紫珠提取物對緩解母豬產(chǎn)后炎癥的作用

母豬在分娩和泌乳時易產(chǎn)生組織損傷，使病原微生物乘虛而入，從而出現(xiàn)生殖系統(tǒng)炎癥和乳腺炎；炎癥發(fā)生時巨噬細胞和外周單核細胞產(chǎn)生的細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等增加，從而誘導(dǎo)發(fā)熱，觸發(fā)細胞凋亡，引起氧化應(yīng)激損傷[27]。這些損傷輕則導(dǎo)致母豬發(fā)熱，泌乳減少，延誤下次配種妊娠，重則使其喪失繁殖能力。體外試驗表明，當(dāng)廣東紫珠提取物質(zhì)量濃度＞40 μg/mL時，可抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細胞TNF-α和IL-8的分泌[7]，說明廣東紫珠提取物具有較強的抗炎效果。本試驗結(jié)果支持了前人的研究結(jié)論，廣東紫珠提取物可以有效降低母豬妊娠、分娩和哺乳階段血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平?？梢?，廣東紫珠提取物對繁殖母豬抗炎有很好的效果。洪燕龍[28]研究發(fā)現(xiàn)，總黃酮對二甲苯涂搽小鼠耳郭造成的急性炎癥模型可顯著抑制致炎后小鼠耳郭的腫脹率，總黃酮對小鼠皮下植入棉球造成肉芽腫增生的慢性炎癥具有明顯的抑制作用；因此認為，廣東紫珠總黃酮為廣東紫珠抗炎的有效成分。

3.4 廣東紫珠提取物對優(yōu)化母豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用

妊娠母體腸道菌群重塑是誘導(dǎo)妊娠代謝紊亂綜合征的重要角色，且妊娠過程中發(fā)生的氧化應(yīng)激會進一步導(dǎo)致母體腸道菌群紊亂。優(yōu)化母豬腸道微生物結(jié)構(gòu)、保持腸道微生態(tài)平衡對維護母豬健康狀況及提高繁殖性能具有重要意義。植物提取物如黃芪多糖、牛至油和皂苷等具有促進乳桿菌屬細菌等有益菌生長、抑制大腸埃希菌等有害菌增殖及維持機體腸道微生物穩(wěn)態(tài)的作用[19]。體外試驗結(jié)果表明，廣東紫珠提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和傷寒沙門菌等有較強的抑制作用[7,29]，但是其體內(nèi)調(diào)節(jié)腸道微生物的效果未見報道。本研究表明，母豬日糧中添加150 mg/kg 及以上廣東紫珠提取物可抑制母豬腸道有害菌大腸埃希菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖，促進乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和擬桿菌屬細菌等有益菌的增殖，與其他植物提取物的效果基本一致。這可能是由于廣東紫珠提取物中連翹酯苷發(fā)揮了抑菌作用，且具有劑量依賴效應(yīng)。有研究報道，連翹的核心成分連翹酯苷可抑制大腸埃希菌、綠膿假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌等有害菌活性，并具有劑量依賴效應(yīng)[30-31]。由本研究可知，廣東紫珠提取物質(zhì)量分數(shù)達150 mg/kg 及以上，對革蘭氏陽性和陰性有害菌均有抑制作用，提高了有益菌的競爭性增殖，從而優(yōu)化母豬腸道菌群結(jié)構(gòu)，促進腸道健康。由于從廣東紫珠提取物中純化單一組分仍比較困難，因此，對其具體抑菌機制仍待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，在妊娠和泌乳母豬飼糧中添加不同水平的廣東紫珠提取物可以改善母豬繁殖性能，提高母豬抗氧能力，緩解產(chǎn)后炎癥，優(yōu)化母豬腸道菌群結(jié)構(gòu)。監(jiān)測指標不同，所得出的廣東紫珠提取物適宜添加量也不同。綜合生產(chǎn)性能、抗氧化及免疫性能等各項指標，推薦母豬飼糧中廣東紫珠提取物適宜添加量為121～165 mg/kg。