山東部分地區(qū)新型鵝星狀病毒ORF2基因克隆及遺傳進化分析

姜勝男 邱楊 趙君 張慧 楊玉棟 李寶全 劉思當 李寧*

山東部分地區(qū)新型鵝星狀病毒ORF2基因克隆及遺傳進化分析

姜勝男①②③?邱楊④?趙君①②③張慧①②③楊玉棟①②③李寶全①②③劉思當①②③李寧①②③*

（①山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 山東 泰安 271000 ②山東省動物生物工程與疾病防治重點實驗室 山東 泰安 ③山東省畜禽疫病防制工程技術(shù)研究中心 山東 泰安 ④山東省泰安市第二中學）

為了解新型鵝星狀病毒(NGAstV)在山東部分地區(qū)的流行和變異情況，試驗采用臨床剖檢、組織病理學觀察和PCR方法對近期來自山東部分地區(qū)的32份病鵝樣品進行NGAstV檢測，并擴增ORF2基因進行遺傳進化分析。結(jié)果表明：發(fā)病雛鵝心臟、肝臟、腎臟等組織有明顯尿酸鹽沉積，腎小管上皮細胞變性、壞死，脾臟部分淋巴細胞壞死，淋巴細胞數(shù)量減少。PCR檢測發(fā)現(xiàn)被檢樣品中共有8份NGAstV陽性，陽性率為25%，擴增并測定其ORF2基因序列后進行遺傳進化分析，顯示獲得的8份毒株與近年來鵝場流行的NGAstV遺傳關(guān)系最近，氨基酸同源性在98.6%~99.6%之間。說明目前山東部分地區(qū)有NGAstv的流行但流行毒株尚未發(fā)生明顯變異。

雛鵝通風 新型鵝星狀病毒 ORF2基因 克隆 進化分析

新型鵝星狀病毒(Novel Goose Astrovirus，NGAstV)是近年來在臨床發(fā)病鵝中分離鑒定的一種新型禽星狀病毒，患病雛鵝精神沉郁，采食下降，臥地倦動，并且伴有生長遲緩等癥狀，剖檢病鵝可見其心臟、肝臟、脾臟等內(nèi)臟表面有明顯的粉末狀白色或黃白色尿酸鹽沉積，腎臟腫大呈蒼白色，關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有大量尿酸鹽沉積[1-2]。雛鵝通常在5日齡左右開始發(fā)病，在10~15日齡為死亡高峰，至20日齡左右時，鵝群的死亡率可達20%~ 30%，給我國養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[3]。

該病從2017年發(fā)病至今，鮮有關(guān)于其流行病學的報道，本試驗對2019年1月至7月，來自山東濟寧、泰安和德州等不同地區(qū)的32份臨床病鵝進行了臨床剖檢和組織病理學診斷，并對NGAstV進行了PCR檢測，結(jié)果共檢測到8份NGAstV陽性樣品，進一步擴增了其ORF2基因，進行遺傳進化分析。本試驗結(jié)果為該病的有效診斷、防控，以及病毒的流行、變異情況提供理論依據(jù)，同時為深入研究該病的致病特點奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIzol RNA抽提試劑、pMD18-T載體、T4 DNA連接酶和大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞，均購自寶生物工程(大連)有限公司；ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；膠回收試劑盒，購自北京康為世紀生物科技公司。其余所使用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；10~12日齡鵝胚購自榮茂畜禽養(yǎng)殖有限公司。

1.2 樣品采集及處理 自2019年1~7月份，對來自山東泰安、濟寧和德州等地區(qū)的送檢病鵝采集肝臟、腎臟等組織，加入含10×青鏈霉素的無菌PBS(1ml/g)，研磨后，研磨液經(jīng)4℃、12000r/min離心10min，取上清液經(jīng)0.22mm濾器過濾后分裝，置-80℃超低溫冰箱中保存，備用。

1.3 病理剖檢及組織學檢測 對送檢的病鵝進行病理剖檢，觀察并記錄病變。同時，采集病鵝心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、腦等組織，4%甲醛固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋和切片等步驟制備常規(guī)病理組織石蠟切片，切片厚度4mm，H.E.染色后，使用光學顯微鏡觀察組織病理學變化。

表1 引物序列信息

1.4 引物設計及合成 根據(jù)GenBank已經(jīng)登錄的NGAstV序列的保守區(qū)設計檢測引物(NGAstV-F/R)和ORF2全長引物(NGAstV-ORF2-F/R)，引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列信息見表1。

1.5 PCR擴增 使用TRIzol方法提取病料RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用檢測引物(NGAstV-F/R)進行PCR擴增，PCR擴增體系(總體積為25ml)：2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)12.5ml，上下游引物各1ml，模板3ml，ddH2O7.5ml。PCR擴增程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共32個循環(huán)；72℃再延伸7min。產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對目的片段進行回收、純化，送青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果利用SeqMan、Editseq等軟件進行序列拼接分析。

1.6 ORF2擴增及遺傳進化分析 使用NGAstV-ORF2-F/R引物擴增NGAstV分離株的ORF2基因全長，然后將其與GenBank中不同宿主來源的17株星狀病毒序列進行比對(表2)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行遺傳進化分析。以NGAstV SDPY-1116-17(登錄號MH052598.1)為參考毒株，分析本試驗獲取的2個NGAstV毒株ORF2氨基酸的突變情況。

表2 NGAstV參考毒株相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢病變 對疑似感染NGAstV的雛鵝進行剖檢觀察，可見內(nèi)臟器官表面覆蓋一層白色粉末狀薄膜。臟腫大，伴有紅白相間的花紋，呈現(xiàn)典型的“花斑腎”病變。患鵝的肺臟淤血水腫，顏色暗紅，表面覆蓋一層灰白色粉末狀尿酸鹽沉積，心包表面有一層白色粉末，肝臟漿膜面覆蓋部分白色粉末狀物腎質(zhì)，肌胃和肌肉也可見明顯的尿酸鹽沉著。

2.2 組織病理學觀察 患病雛鵝內(nèi)臟器官的組織病理學分析顯示，腎臟病變最嚴重，表現(xiàn)為腎小管結(jié)構(gòu)被破壞，上皮細胞變性、壞死、脫落。除此之外，脾臟部分淋巴細胞壞死，淋巴細胞數(shù)量減少，肺間質(zhì)充血、出血，少量炎性細胞浸潤，肝臟充血，肝細胞發(fā)生變性壞死，心肌纖維以顆粒變性為主要特點，腦未見明顯病變。

2.3 PCR檢測、病毒分離鑒定及遺傳進化分析 采集患病鵝的肝臟、腎臟組織樣品，提取RNA，使用NGAstV檢測引物對樣品進行PCR擴增，32份樣品中共有8份可檢測到489 bp的目的條帶，陽性率為25%。將其回收、純化，連接到pMD18-T載體上，挑選陽性克隆測序，序列比對發(fā)現(xiàn)其全部為NGAstV。進一步利用ORF2基因全長引物擴增8份陽性樣品的ORF2全長，結(jié)果成功獲得大小約為2290bp的目的序列，其中包含長度為2115 bp的ORF2基因全長。將其與GenBank上已有的17株AstV序列進行遺傳進化分析，結(jié)果顯示，本試驗獲得的毒株與流行毒株NGAstV-CXZ18、NGA stV-SDPY-1116-17、NGAstV-SD01和NGAstV-GD的親緣關(guān)系最近(附圖)。選取2019WS-576和2019XT-583毒株的ORF2編碼氨基酸與參考毒株SDPY-1116-17進行同源性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其同源性高達99.4%~99.6%，2019XT-583與SDPY-1116-17有4個氨基酸位點差異，分別是第229位由Q突變?yōu)镻，456位E變?yōu)镈，540位L變?yōu)镼，以及第695位T突變?yōu)锳，2019WS-576與SDPY-1116-17僅有3個突變氨基酸位點。

3 討論與結(jié)論

（1）禽星狀病毒可分為3種，分別是禽星狀病毒1型、2型和3型。禽星狀病毒1型包括火雞星狀病毒1型，禽星狀病毒2型包括禽腎炎病毒1型和禽腎炎病毒2型，禽星狀病毒3型有鴨星狀病毒和火雞星狀病毒2型[4]。不同宿主感染禽星狀病毒出現(xiàn)的臨床癥狀有較大差異，例如禽腎炎病毒引起雞腹瀉性腸炎和腎炎[5]；鴨星狀病毒感染雛鴨，導致病毒性肝炎[6]。（2）近年來，我國山東、江蘇、安徽和福建等地鵝場相繼發(fā)生以雛鵝內(nèi)臟、關(guān)節(jié)大量尿酸鹽沉積為主要特征的痛風性疾病。該病發(fā)病率和死亡率高，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了較大經(jīng)濟損失。目前已有學者對雛鵝痛風進行了一系列的臨床診斷和分析，夏偉斌等[7]認為雛鵝痛風的主要原因為長時間攝入高蛋白質(zhì)飼料，導致腎功能下降，而且從營養(yǎng)、環(huán)境等方面對痛風雛鵝進行治療后，效果較為明顯，但這不能排除病毒感染的可能。近期，姜曉寧等[1]對來自山東、安徽、江蘇等地的143份病鵝樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)星狀病毒的檢出率高達96.5%，并分離鑒定了鵝源星狀病毒SDPY株，以病毒ORF1b進行遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)，SDPY株單獨處于一個小的進化分支，與其他雞源、火雞源、鴨源及鵝源星狀病毒代表株同源性均較低，核苷酸同源性為49.5%~67.7%，氨基酸同源性為44.4%~72.6%，表明引起當前雛鵝痛風的星狀病毒為NGAstV。此外，也有多項研究表明NGAstV是鵝內(nèi)臟痛風的主要病原[3, 8]。在本試驗中，從32分臨床樣品中檢測到8份NGAstV，陽性率為25%，剖檢NGAstV感染鵝可見心包和肝臟表面覆蓋有一層白色粉末狀薄膜，腎臟腫大，有明顯的尿酸鹽沉積。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)患病雛鵝的病變主要集中在腎臟，表現(xiàn)為腎小管上皮細胞嚴重脫落、壞死，而心臟、肝臟和脾臟等組織僅表現(xiàn)輕度的細胞變性、壞死，未見其他特征病變。據(jù)此推測出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因在于NGAstV對腎臟有較強的組織嗜性，感染后導致腎組織結(jié)構(gòu)破壞，功能受損，進而引起動物出現(xiàn)代謝障礙，尿酸鹽大量蓄積。臨床上，應該根據(jù)該病剖檢的特征病變和PCR病原學進行綜合診斷。（3）星狀病毒的ORF2基因編碼由704個氨基酸殘基組成的衣殼蛋白，是星狀病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒入侵宿主細胞、病毒粒子組裝等過程發(fā)揮重要作用，同時衣殼蛋白可與宿主抗體、補體發(fā)生相互作用，調(diào)控宿主的免疫反應[9]。在本試驗中，我們擴增了8份陽性樣品的ORF2基因并構(gòu)建遺傳進化樹，發(fā)現(xiàn)其與目前鵝場流行的NGAstV毒株的遺傳關(guān)系最近，氨基酸同源性在97.6%~99.3%之間。衣殼蛋白的N端富含堿性氨基酸，保守性較高，C端為高變區(qū)，編碼的蛋白能夠在病毒粒子表面形成纖突結(jié)構(gòu)，是病毒主要的抗原決定蛋白，同時還能參與病毒與宿主細胞膜融合，對病毒的感染和致病性有重要影響[10]。近期有研究者將NGAstV毒株連續(xù)傳代，然后選取30，50，60，70代次病毒進行全基因組序列測定，發(fā)現(xiàn)病毒編碼區(qū)在傳代過程中共產(chǎn)生了8個氨基酸位點突變，其中有6個突變位于衣殼蛋白，分別是第26，284，489，610，650，660位，更重要的是，第489，610位氨基酸突變可能導致其編碼蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，降低病毒對雛鵝的致病力[11]。以NGASsV-SDPY-1116-17為參考毒株，選取本試驗獲得的兩個毒株與之進行氨基酸同源性分析，發(fā)現(xiàn)毒株2019WS-576有3個氨基酸位點差異，分別為第229，456，540位，而2019XT-583除上述三個突變位點外，還包括第695位，雖然沒有與上述傳代毒株相同的突變位點，但是發(fā)現(xiàn)本研究中的突變位點主要集中在衣殼蛋白的纖突結(jié)構(gòu)，考慮到纖突蛋白在病毒致病過程中的重要作用，這些突變氨基酸能否影響蛋白構(gòu)象、功能，進而影響病毒毒力還需進一步驗證。但是整體上，以上結(jié)果表明目前山東部分地區(qū)流行的NGAstV尚未發(fā)生明顯遺傳變異。（4）目前，關(guān)于新型鵝星狀病毒的研究較少，其主要傳播途徑、致病機制等尚不明確，因此加強對該病的流行病學調(diào)查和分子變異分析有助于該病的有效防控，還能為深入研究該病的致病特點奠定基礎(chǔ)。

注：Δ為試驗獲得的NGAstV毒株ORF2序列。

附圖 臨床NGAstV毒株的ORF2遺傳進化分析

[1] 姜曉寧, 田家軍, 楊晶等. 導致雛鵝痛風新型鵝星狀病毒的分離鑒定[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2018, 38(5): 871-877.

[2] Zhang X Y, Ren D, LI T F, et al. An emerging novel goose astrovirusassociated with gosling gout disease, China [J]. Emerg MicrobesInfect, 2018, 7(1): 1-8.

[3] Zhang Q, CAO Y, Wang J, et al. Isolation and characterization of an astrovirus causing fatalvisceral gout in domestic goslings[J]. Emerg Microbes Infect, 2018, 7(1): 1-11.

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[9] Arias Cf, Dubois RM. The astrovirus capsid: areview [J].Viruses, 2017, 9(1): 15.

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[11] 張清水. 新發(fā)腎致病型鵝星狀病毒的分離鑒定及弱毒株選育[D]. 中國農(nóng)業(yè)大學: 北京, 2018.

“十三五”國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0500100)；中國博士后科學基金面上資助(2019M652450)；山東省“雙一流”獎補資金項目(無編號)

?共同第一作者

（2020–05–01）

S835.2

A

1007-1733(2020)07-0011-04