非酒精性脂肪性肝纖維化動物模型的改良和建立

周玉平，溫晉鋒，周飛，王慶領，楊萍，呂雪幼

（1.寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院 消化內科，浙江 寧波 315020；2.寧波大學 消化疾病研究所，浙江寧波 315020；3.寧波大學醫(yī)學院 生物化學與分子生物學研究所，浙江 寧波 315211；4.寧波衛(wèi)生職業(yè)技術學院 護理學院，浙江 寧波 315100）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已經成為全球最主要的慢性肝病[1]。NAFLD長期發(fā)展的結果必將導致非酒精性脂肪性肝纖維化（hepatic non-alcoholic steatofibrosis，NASF）[2]。系統(tǒng)評價和Meta分析顯示，肝纖維化是NAFLD死亡率的最重要預測因素，與無纖維化相比，有纖維化的NAFLD患者的全因死亡風險增加，并且該風險隨著纖維化階段的增加而增加[3]。由此可見，NASF是NAFLD進展過程中的關鍵環(huán)節(jié)，也是導致其不良結局的重要原因。因此，進一步研究NASF的發(fā)病機制及探索防治NASF的有效藥物是當前的重大課題，但目前尚無理想的NASF動物模型制約了相關的基礎研究。本研究旨在構建一個造模時間相對較短、成功率高、重復性好的動物模型，使之能夠較完整表達人類NASF的病理特點和發(fā)病機制特點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：6～8周齡SFP級C57BL/6J雄性小鼠，體質量（22±4）g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0008。動物飼養(yǎng)于寧波大學實驗動物中心，本研究獲得寧波大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 藥物與試劑：CCl4分析純購自上海國藥集團化學試劑有限公司；蛋氨酸-膽堿缺乏飼料（methionine-choline-deficient diet，MCD，批號TP3005G）及對照飼料（methionine-cholinesupplemented diet，MCS，批號TP3005Gs）購自南通特洛菲飼料科技有限公司；伊紅、蘇木精、苯胺藍均為美國Sigma公司產品；谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、甘油三酯（triglyceride，TG）生化檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；α-平滑肌肌動蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和造模：適應性喂養(yǎng)5 d后，小鼠隨機分成正常組、模型組，正常組8只，模型組16只。正常組給予MCS飼料喂養(yǎng)；模型組采用MCD飲食誘導+每周1次腹腔注射10% CCl4-橄欖油溶液（劑量為2 mL/kg），分4周組和6周組，各8只。

1.2.2 一般指標觀察：每天觀察小鼠的一般狀況，包括自主活動、精神狀態(tài)、毛發(fā)變化等，每周固定時間稱量體質量，最后處死動物后，摘取肝臟濾紙吸干表面水分稱量其濕重，計算肝臟指數(shù)（%）=肝濕重/體質量×100%。

1.2.3 標本留取方法：4周末取4周組、6周末取對照組和6周組小鼠進行指標檢測，動物禁食12 h，3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，打開腹腔，下腔靜脈采血，摘取肝臟，選肝臟最大葉1塊置于4%中性甲醛溶液中固定，用于組織病理染色及免疫組化檢測；另取一較大葉切成方形，OTC包埋后液氮速凍用于冰凍切片；其余EP管分裝液氮速凍后轉移到-70 ℃保存。

1.2.4 生化指標檢測：ALT、AST、TBIL活性檢測及血清、肝臟TG含量檢測均采用生化檢測試劑盒進行。

1.2.5 組織病理學觀察：制作肝組織石蠟切片，行HE染色和Masson染色，觀察組織炎癥、脂肪變性和膠原增生情況。制作肝組織冰凍切片，行油紅O染色，觀察脂滴沉積情況。用Image-Pro Plus 6.0軟件測量各個樣本的陽性染色面積，每個樣本測量5個視野，計算出每張切片的平均陽性面積（μm2）用于統(tǒng)計分析。

1.2.6 免疫組織化學檢測α-SMA表達：常規(guī)制作石蠟切片后二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水；3% H2O2阻斷、滅活內源性過氧化物酶；PBS沖洗后0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液進行抗原修復；滴加一抗（α-SMA，稀釋500倍）；4 ℃冰箱孵育過夜；室溫平衡及PBS沖洗；滴加二抗37 ℃孵育30 min；DAB反應染色；蘇木素復染、干燥、封片；顯微鏡下觀察拍照，每張切片隨機選擇5不同的視野觀察拍照，并用Image-Pro Plus軟件測量陽性染色面積，每個樣本測量5個視野，計算出每張切片的平均陽性面積（μm2）用于統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS20.0軟件進行分析。正態(tài)分布計量數(shù)據以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，2組間進一步比較采用LSD檢驗，若不服從方差齊性，則采用Dunnett-T3檢驗法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 造模后小鼠一般狀況和體質量變化 對照組小鼠生活狀態(tài)良好，毛發(fā)光澤；模型組小鼠隨造模時間延長，皮毛變得疏松油膩，精神萎靡，日漸消瘦。對照組小鼠體質量隨時間延長稍有增加，但趨于穩(wěn)定；模型組則明顯有下降趨勢，尤其在第2、第5周下降最為明顯，自第2周開始模型組小鼠體質量顯著低于對照組（P＜0.01），見表1。

表1 各組小鼠體質量變化比較（每組n=8，±s，g）

表1 各組小鼠體質量變化比較（每組n=8，±s，g）

組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周對照組 25.06±0.91 25.31±0.72 25.54±0.98 27.11±0.15 26.70±0.95 27.88±1.17模型組 24.50±1.15 21.60±1.20 21.05±0.79 20.46±2.79 16.96±1.83 14.89±1.79 t 1.083 7.487 10.080 6.238 13.371 17.153 P 0.297 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 造模后小鼠的肝臟變化及肝指數(shù)情況 造模后的小鼠肝臟可見表面光澤差，顏色偏黃白，有明顯脂肪變性，6周模型小鼠更為明顯，且部分肝臟可見米粒大小的結節(jié)，而對照組小鼠肝臟表面光滑，色澤粉紅，無結節(jié)，無脂肪變性（見圖1）。計算肝臟指數(shù)結果顯示，造模6周后肝臟指數(shù)明顯上升，顯著高于對照組（P＜0.01），見表2。

圖1 各組小鼠肝臟外觀比較

表2 各組小鼠肝臟指數(shù)比較（每組n=8，±s）

表2 各組小鼠肝臟指數(shù)比較（每組n=8，±s）

與對照組比：aP＜0.01；與4周模型組比：bP＜0.01

組別 肝濕重（g） 肝臟指數(shù)（%）對照組 1.02±0.07 3.84±0.214周模型組 0.62±0.02a 3.40±0.066周模型組 0.62±0.07a 4.73±0.38ab F 45.879 21.200 P＜0.001 0.002

2.3 各組小鼠血清ALT、AST、TBIL活性比較 生化檢測結果顯示，相比正常組，模型組血清ALT、AST、TBIL指標均顯著升高（P＜0.01）；6周模型組指標升高更為明顯，較4周模型組顯著升高（P＜0.01），見表3。

表3 各組血清肝功能指標比較（每組n=8，±s）

表3 各組血清肝功能指標比較（每組n=8，±s）

與對照組比：aP＜0.01；與4周模型組比：bP＜0.01

組別 ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L）對照組 23.50± 4.78 153.75± 36.86 2.64±0.554周模型組 182.00±16.10a 243.25± 23.08a 5.73±0.99a 6周模型組 535.38±66.71ab 766.25±159.10ab 9.58±3.44ab F 58.702 96.555 22.087 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組小鼠血清和肝臟TG含量比較 生化檢測結果顯示，相比對照組，模型組血清TG含量顯著下降（P＜0.01），而肝臟TG含量顯著升高（P＜0.01）；其中，6周模型組血清TG含量顯著低于4周模型組（P＜0.01），6周模型肝臟TG含量顯著高于4周模型組（P＜0.01），見表4。

表4 各組血清和肝臟TG含量比較（每組n=8，±s，U/L）

表4 各組血清和肝臟TG含量比較（每組n=8，±s，U/L）

與對照組比：aP＜0.01；與4周模型組比：bP＜0.01

組別 血清TG 肝臟TG對照組 1.26±0.15 188.48±22.324周模型組 1.07±0.07a 377.27±17.56a 6周模型組 0.69±0.06ab 626.10±53.19ab F 54.400 175.806 P＜0.001 ＜0.001

2.5 各組小鼠肝組織病理變化比較 HE染色、油紅O染色及Masson染色顯示，對照組肝組織形態(tài)結構正常，匯管區(qū)無炎癥細胞浸潤；無脂肪變性，無紅色脂滴；只在血管壁可見少量膠原染色。模型組肝組織可見匯管區(qū)炎癥細胞浸潤；大量脂肪變性，胞質內充滿大小較一致的脂滴；膠原沉積明顯增加，竇周可見膠原纖維形成細絲狀甚至粗索狀分布，肝小葉結構紊亂，也可見纖維組織增生；其中6周模型的病理改變較4周模型明顯加重，見圖2。半定量分析顯示，模型組的脂滴和膠原面積顯著高于對照組（P＜0.05）；6周模型組顯著高于4周模型組（P＜0.05），見表5。

表5 各組肝組織病理染色陽性面積比較（每n=8，±s，μm2）

表5 各組肝組織病理染色陽性面積比較（每n=8，±s，μm2）

與對照組比：aP＜0.01；與4周模型組比：bP＜0.05

組別 油紅O染色 Masson染色 α-SMA蛋白表達對照組 758.4± 125.7 2827.7± 453.7 425.6± 37.94周模型組 71709.7± 9273.9a 26536.4±3039.7a 2233.9± 77.8a 6周模型組 119173.0±15862.9ab 35614.1±6394.8ab 2988.8±161.1ab F 94.663 102.471 470.323 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖2 各組小鼠肝臟組織病理學改變比較

2.6 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白表達比較 免疫組織化學染色檢測α-SMA蛋白表達結果顯示：對照組肝組織見少量α-SMA表達在血管壁；模型組肝組織α-SMA陽性染色明顯增多，主要見于匯管區(qū)，肝血竇和纖維間隔；其中6周模型的陽性表達較4周模型明顯增加。見圖3。染色陽性面積的半定量分析顯示，模型組陽性表達面積顯著高于對照組（P＜0.01）；6周模型組又顯著高于4周模型組（P＜0.01），見表5。

圖3 各組小鼠肝組織α-SMA蛋白免疫組織化學染色（×100）

3 討論

NASF的基礎研究及新藥開發(fā)是肝病研究領域的熱點和難點，研制理想的動物模型是當前需要迫切解決的問題。NAFLD模型較為成熟，其中高脂飲食、MCD飲食誘導的模型應用最為廣泛[4]。雖然NAFLD模型研究取得了較大進展，然而，構建由單純性脂肪肝過渡到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatchepatitis，NASH）再到肝纖維化肝硬化這樣反映NAFLD全病程的動物模型的方法并不多見。雖然高脂飲食和MCD飲食誘導的模型能較好地模擬NASH的病理特點，但較難出現(xiàn)纖維化和肝硬化改變。NASF模型復制較為困難，一定程度上制約了相關的基礎和藥物開發(fā)研究。

有研究者將MCD飲食喂養(yǎng)時間延長至8周，以期復制簡易可靠的NASF模型，結果雖然小鼠肝臟出現(xiàn)嚴重的脂肪變性，但Masson染色結果提示肝纖維化僅為1-2級[5]。劉洋等[6]的6周MCD小鼠模型發(fā)現(xiàn)，雖然MCD組小鼠肝組織中α-SMA、COL1A1、TGF-β1等纖維化相關的mRNA表達顯著升高，但組織病理學檢測仍未見明顯的肝纖維化改變。雖然膽堿缺乏并添加乙硫氨酸飲食模型可復制NASF病理過程，短期喂食可使動物肝臟發(fā)生脂肪變性、炎癥，長期喂食則可使動物肝臟發(fā)生纖維化、硬化甚至肝癌，但此方法的缺點是動物體質量下降超過20%，死亡率非常高，大大增加實驗的難度，并降低了可重復性。蓋曲倞等[7]對該模型經過改良大大降低了死亡率，成功建立小鼠NASH及肝纖維化的模型，但造模時間需要16周。高脂飲食誘導的大鼠模型出現(xiàn)肝纖維化，造模時間則更久，一般需要24周以上[8-9]。TSUCHIDA等[10]報道了一種可迅速進展為肝纖維化和肝癌的NASH小鼠模型，研究者給予C57BL/6J小鼠富含高脂、高糖和高膽固醇的飲食，結合每周在腹腔內給予低劑量的促進劑CCl4，建立了一種具有快速廣泛纖維化和肝細胞癌進展的NASH小鼠模型，在12周可產生第3階段纖維化，并且在24周發(fā)展成肝癌，該模型12周可出現(xiàn)明顯肝纖維化改變，且動物死亡率低，是目前較為理想的模型，但造模時間仍相對較長，且高糖、高脂、高膽固醇的飲食不符合我國的飲食特點。

可見目前NASF動物模型存在病理改變不明顯、造模周期長、動物死亡率高、重復性差等問題，有必要進一步改良或研制新的模型。本課題組在大量文獻調研基礎上提出了一種新的造模方案：即在常規(guī)MCD飲食誘導的基礎上，反復給予低劑量的CCl4的腹腔注射，結果顯示，該方法6周能較好模擬NASF病理表現(xiàn)，出現(xiàn)嚴重脂肪變、肝臟炎癥及明顯的肝纖維化改變（分級為3～4級），肝纖維化形成關鍵細胞即星狀細胞活化的標志物α-SMA的表達也顯著增多，血清肝功能明顯異常，肝臟脂肪含量顯著增多且無動物死亡情況。需要指出的是，此種模型與大部分NAFLD患者存在代謝綜合征的表型有所差異，我們觀察到小鼠攝入MCD后，攝食量有所減少，體質量逐漸下降，且血脂水平顯著降低，這是本模型的不足之處。

MCD飲食誘發(fā)的C57BL/6J小鼠模型的造模原理是通過飲食中蛋氨酸與膽堿的缺乏造成線粒體β-氧化功能障礙和極低密度脂蛋白合成與分泌減少，從而使TG在肝細胞內迅速大量堆積，導致肝細胞脂肪變性，造成“第一次打擊”[11]；進而，由于肝細胞的脂肪變性，線粒體減少對游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的攝入，促使FFA的β-氧化增加，導致ROS的合成和脂質過氧化反應，形成對肝臟的“第二次打擊”，最終導致NASH的發(fā)生[12]。CCl4具有肝毒性，進入機體后在肝內產生活化氧自由基，過氧化作用增強，加快肝脂肪變性進程，損傷肝細胞，造成肝細胞變性壞死，引起細胞外基質過度沉積而成肝纖維化，其代謝產物還可以刺激肝臟枯否細胞，釋放促炎性細胞因子，進一步加重肝臟的損傷。CCl4誘導的化學肝損傷是經典的肝纖維化模型，但其發(fā)病機制、病程演變過程和組織形態(tài)的改變都與人類脂肪肝差異較大，高濃度CCl4造模藥物毒性強，肝細胞壞死、炎癥和纖維化發(fā)生早而嚴重，動物死亡率高[13]。本研究聯(lián)合MCD飲食和反復的低劑量注射CCl4，揚長避短，成功復制了NASF模型，符合人類NASF的發(fā)病機制和病理表現(xiàn)特點，可用于臨床藥效評價和新藥研究。