miR-10b 對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響

郭樂(lè)薇 ,趙 靜 ,劉紅羽 ,王 軍* ,呂文發(fā)*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國(guó)際合作聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生產(chǎn)與產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春 130118）

卵巢作為雌性動(dòng)物的重要繁殖器官，卵子生成和排卵以及性腺激素合成分泌均影響動(dòng)物的繁殖性能[1-2]。卵泡是卵巢的基本功能單位[3]，每個(gè)卵泡均由顆粒細(xì)胞包圍一個(gè)卵母細(xì)胞組成。作為卵巢中必需的體細(xì)胞，顆粒細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)環(huán)境下以增殖和凋亡的形式共同存在。顆粒細(xì)胞的增殖分化會(huì)促進(jìn)卵泡發(fā)育、配子發(fā)生等生理過(guò)程[4-5]；而其凋亡是卵泡閉鎖的主要原因[6]。

MicroRNA（miRNA）是長(zhǎng)度為20～25 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其通過(guò)靶向mRNA 3 ′UTR 內(nèi)的部分互補(bǔ)序列起作用，降解或抑制其翻譯。miRNA 通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞過(guò)程在生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮作用[7-8]。miRNA 參與卵巢卵泡發(fā)育的整個(gè)過(guò)程，包括卵泡生長(zhǎng)、閉鎖和排卵[9]。miR-10 家族位于HOX基因簇內(nèi)，包括miR-10a 和miR-10b[10]。HOX 不僅可維持正常組織的增殖與分化過(guò)程，而且其突變會(huì)引起雌性生殖道和子宮發(fā)育異常，導(dǎo)致不孕[11]。miR-10 家族在早期胚胎發(fā)育期間與HOX 共表達(dá)[12]，推測(cè)miR-10b在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。魏金銷(xiāo)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-10b 可抑制山羊卵巢顆粒細(xì)胞的活性。然而目前關(guān)于miR-10b 對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞的影響尚不清楚。本研究旨在通過(guò)Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）、Western Blot 和流式細(xì)胞術(shù)探究miR-10b 對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，為減少母畜卵泡資源浪費(fèi)、提高母畜繁殖能力提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 DMEM/F12（Gibco，美國(guó)）；雙抗（生工生物工程有限公司，中國(guó)）LipofectamineTM2000（賽默飛世爾科技公司，中國(guó)）；miR-10b 模擬物（mimics）和mimic NC（蘇州吉瑪基因股份有限公司，中國(guó)）；總RNA 提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本）；RIPA 裂解液、SDSPAGE 凝膠快速配制試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，中國(guó)）；Intercept?（PBS）Blocking Buffer（LI-COR，美國(guó)）；超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（新賽美生物科技有限公司，中國(guó)）；細(xì)胞凋亡試劑盒（BD Pharmingen，美國(guó)）。

1.2 牛卵巢采集和卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)所用卵巢均從屠宰場(chǎng)剛屠宰的母牛身上取出，新鮮卵巢組織浸潤(rùn)在37℃含雙抗（鏈霉素和青霉素的混合液）的生理鹽水中，并在3 h 內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。手術(shù)剪剪去卵巢周?chē)嘤嘟M織，使用37℃含雙抗的生理鹽水沖洗2 次，75%酒精浸泡30 s，再用37℃含雙抗的生理鹽水沖洗3～5 次。移入無(wú)菌操作臺(tái)，使用5 mL 注射器抽吸3～6 mm 的健康卵泡。卵泡液經(jīng)1 000 r/min 離心5 min，細(xì)胞沉淀用37℃含雙抗的DMEM/F12 重懸細(xì)胞，重復(fù)2～3 次。細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×106～1.2×106的密度接種，轉(zhuǎn)移至37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，24 h 后棄細(xì)胞上清液，換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求，進(jìn)行相應(yīng)處理。

1.3 牛卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在轉(zhuǎn)染前1 d，將細(xì)胞接種至60 mm 板中（1×106個(gè)/孔），加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，保證其在第2 天細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%。分別使用1 250 μL DMEM/F12稀釋500 pmol miR-10b mimics和mimics NC 并混勻，序列見(jiàn)表1。1 000 μL DMEM/F12稀釋20 μL LipofectamineTM2 000，混勻并室溫靜置5 min。將前兩步的預(yù)混液混合，室溫孵育20 min。用PBS 沖洗細(xì)胞3 次，每板加入混合液并加入DMEM/F12 補(bǔ)充至4.5 mL，輕晃混勻，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。6 h 后每板加入500 μL 胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，提取RNA 和蛋白用于后續(xù)檢測(cè)。

表1 miR-10b mimics/NC 序列

1.4 RNA 提取和qRT-PCR TRIzol 法提取牛卵巢顆粒細(xì)胞總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRT-PCR 檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)所需的引物由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。qRT-PCR 反應(yīng)體系20 μL：2 μL cDNA 模板，10 μL SYBR Premix Ex Taq II，0.4 μL ROX reference Dye II，上游、下游引物各0.8 μL（0.4 μmol/L），6 μL ddH2O。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；40×（95℃ 5 s，56～64℃34 s）；95℃ 15 s，60℃ 60 s，95°C 15 s。用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本進(jìn)行3 次重復(fù)分析。

1.5 蛋白提取和Western Blot RIPA 裂解液提取牛卵巢顆粒細(xì)胞的總蛋白，根據(jù)BCA 說(shuō)明書(shū)檢測(cè)處理樣品蛋白濃度。配制12%聚丙烯酰胺凝膠，上樣40 μg/孔。80 V 電壓電泳至分離膠，更換電壓為160 V，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，0.12 A 28 min。使用Intercept?（PBS)Blocking Buffer 封閉1.5 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌5 min/5 次，二抗孵育1 h，TBST 洗滌5 min/5 次，隨后用ECL 發(fā)光液顯影,用Tanon Gis 軟件進(jìn)行灰度值分析?？贵w信息見(jiàn)表3。

表2 qRT-PCR 引物序列

表3 Western Blot 抗體信息

1.6 流式細(xì)胞術(shù) 將處理好的細(xì)胞棄液，PBS 沖洗3遍，胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清。再用PBS 重懸細(xì)胞1 000 r/min 離心5 min，重復(fù)2 次。根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒要求，加入200 μL 1×Buffer，PI 和FITC 各5 μL，37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，再加入100 μL 1×Buffer。過(guò)膜至流式管中，立即上機(jī)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用GraphPad prism 5.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-10b 轉(zhuǎn)染驗(yàn)證 qRT-PCR 檢測(cè)內(nèi)源miR-10b的表達(dá)，驗(yàn)證miR-10b 的轉(zhuǎn)染效率。如圖1 所示，與mimics NC 組比較，miR-10b mimics 組中miR-10b 表達(dá)量極顯著升高，表明miR-10b mimics 轉(zhuǎn)染成功。

2.2 qRT-PCR 檢測(cè)凋亡相關(guān)基因 如圖2 所示，與mimics NC 組相比，miR-10b mimics 組Bax（P＜0.01）和Caspase-3（P＜0.05）mRNA 表達(dá)水平升高，Bcl-2mRNA 表達(dá)水平降低（P＜0.05）。表明miR-10b 可影響凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。

2.3 Western Blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 如圖3 所示，與mimics NC 組相比，miR-10b mimics 組Bax（P＜0.01）和Caspase-3（P＜0.05）蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著極降低。與qRT-PCR 結(jié)果一致，表明miR-10b 可影響凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。

2.4 細(xì)胞凋亡水平檢測(cè) 如圖4 所示，與mimics NC 組相比，miR-10b mimics 組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.01）。

3 討論

在卵泡發(fā)育過(guò)程中，卵母細(xì)胞和周?chē)w粒細(xì)胞之間的相互作用對(duì)于正常的卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟至關(guān)重要[14]。因此，卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡會(huì)影響母畜的繁殖性能。miRNA 可調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞增殖、凋亡和分化。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明miRNA 在顆粒細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用。體內(nèi)卵巢氧化應(yīng)激模型中miR-181a 通過(guò)下調(diào)SIRT1 使FoxO1 乙?；M(jìn)而促進(jìn)鼠顆粒細(xì)胞凋亡，損害其卵泡發(fā)育；而敲除內(nèi)源性miR-181a 則阻止了H2O2誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡[15]。miR-1275 是在豬卵巢卵泡閉鎖過(guò)程中差異表達(dá)的miRNA 之一。研究發(fā)現(xiàn)miR-1275 可抑制雌二醇（E2）釋放和CYP19A1 的表達(dá)，以促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞的早期凋亡，引發(fā)豬卵巢卵泡閉鎖[16]。Wang 等[17]研究表明，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）參與卵泡生長(zhǎng)，用miR-125a-5p mimics 轉(zhuǎn)染小鼠顆粒細(xì)胞觀察到STAT3 表達(dá)降低，Cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)升高，顆粒細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)miR-10b 可促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，影響凋亡相關(guān)因子表達(dá)。

miR-10 家族在不同物種之間高度保守。Tu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-10b 可通過(guò)抑制TGF-β途徑抑制人、小鼠和大鼠顆粒細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。CYP19A1 編碼芳香酶，是E2合成中的關(guān)鍵酶，在豬卵泡閉鎖過(guò)程中被下調(diào)。Li 等[19]研究發(fā)現(xiàn)miR-10b 可通過(guò)靶向CYP19A1 抑制E2釋放參與豬卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）及其高親和力受體酪氨酸激酶受體B 被認(rèn)為與雌性生殖有關(guān)。最近已證明在卵泡活化和卵母細(xì)胞成熟中起著重要作用。Peng 等[20]使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定法將BDNF基因鑒定為miR-10b 的直接靶標(biāo)，證明了miR-10b 可通過(guò)直接靶向BDNF 抑制山羊顆粒細(xì)胞增殖。然而，關(guān)于miR-10b 對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞的作用尚不清楚。許多凋亡信號(hào)因子（Bax、Bcl-2 和Caspase-3等）在顆粒細(xì)胞中發(fā)揮作用。Bax 可通過(guò)破壞線粒體內(nèi)外膜完整性來(lái)對(duì)抗抗凋亡基因[21]，與健康卵泡相比，閉鎖卵泡顆粒細(xì)胞中Bax 的表達(dá)更高[22]。Bcl-2 可定位至線粒體內(nèi)外膜上發(fā)揮作用對(duì)抗凋亡[23]，Bcl-2 過(guò)表達(dá)可減少有腔卵泡的顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)卵泡發(fā)生[24]。Caspase-3 是引起細(xì)胞凋亡的起始因子[25]，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的凋亡，Caspase-3基因敲除小鼠表現(xiàn)出顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著降低[26]。本研究將miR-10b mimics 轉(zhuǎn)染牛卵巢顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-10b 可促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡且伴隨著B(niǎo)cl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)降低，Bax 和Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)升高。本研究結(jié)果與以往報(bào)道一致，表明miR-10b 在不同物種中的顆粒細(xì)胞中具有相似的功能且高度保守。盡管本研究已證明miR-10b 可促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，但其作用機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，miR-10b 可促進(jìn)牛卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，顯著降低Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，顯著升高Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)水平。