雞FSHβ、ESRα、IGF-1、OVR 基因多態(tài)性和聚合基因型與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析

孫 杰，任 嵩，張 蕾,秦玉梅,廖和榮

（新疆石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

家禽產(chǎn)蛋行為受到下丘腦-垂體-性腺軸三者構(gòu)成的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)系統(tǒng)的調(diào)控，促卵泡素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）和雌激素（Estrogen，E2）作為調(diào)控軸上重要的激素，對卵巢卵泡的生長發(fā)育、優(yōu)勢卵泡的選擇起到主效調(diào)控作用[1]。FSH 有2 個常見的α亞基和β亞基[2]，其可促進(jìn)雌性動物卵泡內(nèi)膜細(xì)胞分化、顆粒細(xì)胞增生和卵泡液的分泌，尤其在刺激母雞的卵泡發(fā)育、成熟直至排卵中發(fā)揮著促進(jìn)作用[3]。ESR是一種與特異激素應(yīng)答DNA 元件相結(jié)合的激活轉(zhuǎn)錄因子，有ESRα、ESRβ2 種亞型[4]。ESRα和ESRβ在機(jī)體組織中分布有較大差異，在陰道至輸卵管的上皮中，ESRβ的表達(dá)量呈現(xiàn)緩慢增加趨勢，而ESRα的表達(dá)量則相反，這些差異可能被視為不對稱卵巢發(fā)育的一個重要原因[5]。IGF-I（Insulin-Like Growth Factor-1）在促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌激素方面與FSH 具有協(xié)同促進(jìn)作用。當(dāng)卵泡發(fā)育至成熟階段，顆粒細(xì)胞增殖活性會逐漸降低，分化能力開始加強(qiáng)并促進(jìn)孕酮分泌，IGF-I 通過上皮細(xì)胞自身受體促進(jìn)這種分化的實(shí)現(xiàn)，使孕酮分泌增加，進(jìn)而促進(jìn)排卵[6-7]。有研究表明，雌性大鼠IGF-I 敲除后，卵巢不含竇卵泡，即使用外源性促性腺激素處理后也不能排卵[8]。因此IGF-1 是一種最有效的卵泡生存因子，可有效防止閉鎖卵泡現(xiàn)象的發(fā)生。雞卵細(xì)胞卵黃生成受體（Oocyte Vitellogenesis Receptor，OVR）是低密度脂蛋白受體家族中的一員，低密度脂蛋白受體家族的成員廣泛結(jié)合在細(xì)胞外配體，位于卵母細(xì)胞表面的特殊受體可以介導(dǎo)血液運(yùn)輸?shù)穆腰S前體物質(zhì)通過胞吞作用進(jìn)入卵巢從而在卵泡中沉積，形成卵黃[9]。

玫瑰冠雞（Rose Cockscomb Chicken，RCC）的冠形優(yōu)美，肉質(zhì)鮮嫩，極具觀賞和食用價值，資源群的微衛(wèi)星多態(tài)性分析表明玫瑰冠雞群體內(nèi)遺傳變異大，遺傳多樣性豐富，可選擇的潛力大[10]，是優(yōu)質(zhì)的育種素材。因此運(yùn)用SNPs 檢測玫瑰冠雞產(chǎn)蛋性能及蛋品質(zhì)性狀相關(guān)分子標(biāo)記，對玫瑰冠雞的生產(chǎn)養(yǎng)殖和開發(fā)利用有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品與數(shù)據(jù)收集 在石河子大學(xué)動物科技學(xué)院試驗(yàn)站收集健康玫瑰冠雞242 只、海蘭褐蛋雞176 只的初生重（BW）、開產(chǎn)日齡（AFE）、開產(chǎn)體重（PBW）、開產(chǎn)蛋重（PEW）、300 日齡產(chǎn)蛋數(shù)（NE300d）和300日齡平均蛋重（AEW300d）等指標(biāo)；分別測定31～32 周齡期間的蛋樣，測定蛋形指數(shù)（EI）、蛋殼厚度（EST）、蛋殼強(qiáng)度（ESS）、蛋重（EW）、蛋白高度（AH）、哈氏單位（HU）、蛋黃顏色（YC）、蛋白重（PW）、蛋黃重（YW）、蛋殼重（ESW）等蛋品質(zhì)性狀指標(biāo)；同時采集32 周齡的玫瑰冠雞242 只、海蘭褐蛋雞176只血液2.0 mL，肝素鈉抗凝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計與PCR 擴(kuò)增 根據(jù)GenBank 已經(jīng)公布的雞FSHβ基因序列（登錄號：AF467082.2）、ESRα基因序列（登錄號：NC_006090.4）引物見文獻(xiàn)[11]，IGF-1基因序列（登錄號NC_006088.4），OVR基因序列（登錄號：NC_006127.4）采用Primer5.0 軟件在線設(shè)計，引物序列見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR擴(kuò)增體系15 μL：2×Es Taq Master Mix 6.5 μL，模板DNA 0.5 μL（50 ng/μL），上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），ddH2O 7.2 μL。擴(kuò)增程序：預(yù)變性94℃2 min，變性94℃ 30 s，退火 30 s，延伸72℃ 30 s，32個循環(huán)，終延伸72℃ 5 min，4℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 SSCP 分析和測序 將3 μL PCR 產(chǎn)物和8 μL 上樣緩沖液混合，98℃變性10 min，再迅速冰浴10 min，把變性好的PCR 產(chǎn)物10 μL 加于12%的聚丙烯酰胺凝膠（Acr:Bis=29:1）中，先220 V 電壓預(yù)電泳10 min，再120 V 電壓過夜電泳，銀染顯色，拍照記錄。根據(jù)電泳圖譜判斷基因型，對于存在多態(tài)位點(diǎn)的每種基因型挑取5 個樣PCR，經(jīng)電泳鑒定，膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段，純化后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.3 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計各基因型個數(shù)，采用SPSS 19.0 計算基因型頻率和基因頻率?；蚺c性狀之間的關(guān)聯(lián)分析運(yùn)用SAS V8 軟件，建立GLM 模型進(jìn)行最小二乘分析：單基因型效應(yīng)關(guān)聯(lián)分析Yij=μ+Gj+eij；聚合基因型關(guān)聯(lián)分析Yij=μ+FSHβ基因型效應(yīng)+ESRa 基因型效應(yīng)+IGF-1基因型效應(yīng)+OVR基因型效應(yīng)+基因型間互作效應(yīng)+eij，其中Yij為性狀觀察值，μ 為群體均值，Gj為標(biāo)記基因型效應(yīng)，eij為隨機(jī)殘差效應(yīng)。組間差異結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示?；虻募兒隙龋℉o）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）的計算公式如下：

式中,Ho 為某一位點(diǎn)的基因純合度，Pi 為第i 個等位基因的頻率，n 為某一位點(diǎn)的等位基因數(shù)。

式中，He 為某一位點(diǎn)的基因雜合度，Ho 為某一位點(diǎn)的基因純合度。

Ne=1/Ho

式中，Ne 為有效等位基因數(shù)，Ho 為某一位點(diǎn)的基因純合度。

式中，Ho 為某一位點(diǎn)的基因純合度，n 為某一位點(diǎn)的等位基因數(shù)，Pi 和Pj 分別為第i 和第j 個等位基因在群體中的頻率。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP 檢測結(jié)果FSHβ、ESRα基因PCR-SSCP檢測分別存在A-173G、C-158689G 突變位點(diǎn)[11]，IGF-1和OVR基因的PCR 產(chǎn)物經(jīng)SSCP 分析后，玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞均檢測到AA、AB 和BB 基因型（圖1、2），將各基因型PCR 擴(kuò)增純化后測序并與GenBank的序列比對發(fā)現(xiàn)IGF-1基因存在A-38965G 突變位點(diǎn)（圖3），該位點(diǎn)發(fā)生在外顯子3，導(dǎo)致第94 位氨基酸由Glu（GAA）突變?yōu)镚lu（GAG）。OVR基因存在G-10394T突變位點(diǎn)（圖4），位于外顯子11，導(dǎo)致第588 位氨基酸由Gly（GGC）錯義突變?yōu)镃ys（TGC）。

2.2 基因型頻率及等位基因頻率 統(tǒng)計FSHβ、ESRα結(jié)果見[11]，突變位點(diǎn)A-173G、C-158689G 的等位基因A是2 種雞的優(yōu)勢等位基因；IGF-1、OVR基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)SSCP 分析后的各基因型數(shù)，計算遺傳結(jié)構(gòu)指標(biāo)見表2。在A-38965G 位點(diǎn)，等位基因B 是海蘭褐蛋雞的優(yōu)勢等位基因。G-10394T 位點(diǎn)，玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞均是AB 基因型略占優(yōu)勢，A 基因頻率高于B。PIC 都處于中度多態(tài)。χ2檢驗(yàn)表明，海蘭褐蛋雞在G-10394T位點(diǎn)處于不平衡狀態(tài)（P＜0.05）。

2.3 候選基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析 玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞FSHβ和ESRα基因A-173G位點(diǎn)、C-158689G 位點(diǎn)的基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析見[11]。

IGF-1、OVR位點(diǎn)的不同基因型與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀作關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表3所示，玫瑰冠雞A-38965G突變位點(diǎn)AB 型AFE 和NE300d與AA 型差異顯著，AB型EW、HU 和PW 顯著高于BB 基因型，與AA 型差異不顯著。海蘭褐蛋雞BB 型AFE 顯著早于AA 型，NE300d、AEW300d顯著高于AB 型，略高于AA 型?？蓪B 型視為海蘭褐蛋雞產(chǎn)蛋性能的優(yōu)勢基因型。

玫瑰冠雞G-10394T 突變位點(diǎn)AB 型的AFE 與NE300d均顯著高于AA 型和BB 型。AB 型HU、PW 和ESW 比BB 型分別顯著高出14.17%、17.19%、64.11%，可將AB型視為該位點(diǎn)優(yōu)勢基因型。海蘭褐蛋雞BB 基因型的AFE、AEW300d顯著高于AB 基因型，EW 和YW 顯著高于AB 型9.92%、24.57%，ESW 高于AA 型49.14%。

2.4FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR基因聚合與產(chǎn)蛋性能的關(guān)聯(lián)性分析 綜合分析FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR基因多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性，將4 個位點(diǎn)基因型聚合共60 種，僅對頻率高于5%的基因型與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表4 所示，聚合基因型GP6 的頻率在玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞中均為最高，分別是13.84%和14.20%。

由表5 可知，玫瑰冠雞聚合基因型GP3 的BW 顯著高于GP1、GP2，GP5 的AFE 顯著早于GP6，NE300d極顯著高于GP2、GP3、GP6，顯著高于GP1 和GP4，GP5 是優(yōu)勢聚合基因型。海蘭褐蛋雞聚合基因型GP6和GP10 的BW 顯著高于GP7、GP8，GP6 的AFE 極顯著早于GP7、GP9，GP6 和GP10 的NE300d極顯著高于GP7，可將GP6 視為海蘭褐蛋雞優(yōu)勢聚合基因型。

表2 基因型頻率、基因頻率及群體遺傳結(jié)構(gòu)指標(biāo)

表4 FSHβ、ESRα、IGF-1、OVR 部分聚合基因型頻率分布

表5 FSHβ、ESRα、IGF-1、OVR 聚合基因型與產(chǎn)蛋性能關(guān)聯(lián)分析（最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

2.5FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR聚合基因型與蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析 由表6 可知，玫瑰冠雞聚合基因型GP3 的ESS 極顯著高于聚合基因型GP1、GP2；GP1、GP4 的HU 顯著高于GP3，與GP2、GP5、GP6 差異不顯著；GP4 和GP6 的PW 顯著高于GP1，因此可將GP4 視為玫瑰冠雞蛋品質(zhì)性狀的優(yōu)勢聚合基因型。

表6 FSHβ、ESRα、IGF-1、OVR 聚合基因型與蛋品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析（最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

海蘭褐蛋雞聚合基因型GP8 的HU 極顯著高于GP6和GP7，顯著高于GP9，GP7 的EW、PW 均顯著高于GP10，高于聚合基因GP6、GP8（P＜0.05），YC、YW及ESW 均高于其他聚合基因型而差異不顯著。綜合分析，可將GP7視為海蘭褐蛋雞蛋品質(zhì)性狀的優(yōu)勢聚合基因型。

3 討 論

3.1FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR基因多態(tài)性與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析 本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SHβ基因A-173G 突變位點(diǎn)中AB 型、BB 型分別是玫瑰冠雞和海蘭褐蛋雞AFE、NE300d 相關(guān)的優(yōu)勢基因型。Li 等[12]在蘇肯雞FSHR 啟動子區(qū)域SNP 檢測到C-1684T 位點(diǎn)TC 基因型的AFE 顯著高于CC 基因型，C-1608T 位點(diǎn)CC 基因型AFE 顯著高于TC 基因型，東鄉(xiāng)雞C-1684T 位點(diǎn)CC 基因型在43 周齡產(chǎn)蛋數(shù)顯著高于TC 基因型，表明FSH 與雞的產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。

ESRα基因C-158689G 位點(diǎn)的突變導(dǎo)致第441 位氨基酸由Cys 轉(zhuǎn)變?yōu)門rp，屬于有義突變，其中玫瑰冠雞AB 型顯著影響NE300d、AEW300d；海蘭褐蛋雞BB 基因型NE300d顯著高于AA 型，高于AB 型但不顯著。周俊等[13]報道，ESRα基因5'側(cè)翼調(diào)控區(qū)的CC 型和CD 型36 周平均產(chǎn)蛋量差異顯著，沒發(fā)現(xiàn)DD 型。鵪鶉ESRα基因外顯子1、8 的突變位點(diǎn)分別與AFE、PEW 有一定關(guān)聯(lián)性[14]。以上研究均表明，ESRα基因存在單核苷酸多態(tài)性，且與家禽的產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)。

IGF-1基因檢測到在A-38965G 存在堿基突變位點(diǎn)，導(dǎo)致第94 位氨基酸由Glu 同義突變?yōu)镚lu。OVR基因的G-10394T 多態(tài)位點(diǎn)使第588 位氨基酸由Gly 錯義突變?yōu)镃ys，PIC都處于0.289～0.381，屬于中度多態(tài)。Nagaraja等[15]、Bian 等[16]在IGF-1基因上均發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，其多態(tài)性及不同的單倍型組合對2～12 周齡的ESW、EW、體重及料蛋比有顯著影響。Abdalhag 等[17]研究表明IGF-1基因存在點(diǎn)突變g.295T＞C，發(fā)現(xiàn)CC 基因型與PEW 顯著相關(guān)。Wang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)OVR基因2 個SNP 位點(diǎn)分別與鴨的產(chǎn)蛋量、AFE 和PBW 呈顯著或極顯著相關(guān)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。同義單核苷酸多態(tài)性不產(chǎn)生改變的編碼序列，因此預(yù)期它們不改變自身指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)功能，但Kimchi 等[19]已經(jīng)證實(shí)不改變蛋白質(zhì)序列的同義突變也會影響蛋白質(zhì)功能，且Gartner 等[20]研究了癌癥基因組學(xué)領(lǐng)域的同義突變，結(jié)果表明同義改變在人類癌癥中發(fā)揮作用。因此堿基的轉(zhuǎn)移、顛換偏差和密碼子頻率偏差對同義和非同義突變率的評估都具有顯著影響。

3.2FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR聚合基因型與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)性分析 家禽產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀等遺傳改良傳統(tǒng)上僅限于使用定量遺傳方法，這些性狀受多基因以及環(huán)境因素控制。研究表明單個遺傳標(biāo)記效應(yīng)相對較小，從單基因角度進(jìn)行分子輔助育種不能達(dá)到全面提升經(jīng)濟(jì)性狀的目的，聚合基因型方法比單個SNP分析更加完善，可提供更加豐富的遺傳信息[21]，通過優(yōu)勢基因型的有效整合，更有利于利用標(biāo)記輔助選擇對畜禽進(jìn)行遺傳改良。本研究結(jié)果表明，玫瑰冠雞聚合基因型GP3 和GP5 極顯著影響ESS 和NE300d，是優(yōu)勢聚合基因型；海蘭褐蛋雞聚合基因型GP6 的AFE、NE300d顯著高于其他基因型。本實(shí)驗(yàn)表明，單個基因型多態(tài)位點(diǎn)與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀間達(dá)到不同程度顯著關(guān)聯(lián)，但聚合基因型與部分產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀間達(dá)到極顯著差異。洪坤月等[22]檢測了太湖雞PRL、PRLR 和FSHβ基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)聚合基因型AADD 是產(chǎn)蛋量的有利基因型。優(yōu)質(zhì)肉雞M 系NPY、NCOA-1、IGF-1和GDF-9聚合基因型AaBBCCGg 基因型在AFE、PBW 和300 日齡合格種蛋率上顯著優(yōu)于其他基因型，可作為有效改良優(yōu)質(zhì)肉雞繁殖性能的候選標(biāo)記[23]。Du 等[24]研究湖羊FSHR5'側(cè)翼序列的約1.5 kb 區(qū)域，檢測到4 種變異體（c-518T＞C、c-466C＞ T、c-414A＞ G 和c-365C＞T），發(fā)現(xiàn)6 種基因型和3 種單倍型，關(guān)聯(lián)分析顯示這些多態(tài)性與湖羊的產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)。采用優(yōu)良基因聚合的育種方法，不同基因可能控制相同性狀，也可能控制不同性狀，由于不同性狀之間的代償作用，或者聚合基因型后使得與單個基因型有關(guān)聯(lián)的個體數(shù)分散，分布不均勻，使得本研究分析中與產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)的指標(biāo)很少，但個別表現(xiàn)出極顯著差異，這也說明基因型的不同組合對于基因中的某些突變模式和其他細(xì)胞周期調(diào)控具有選擇性優(yōu)勢，突破了傳統(tǒng)育種技術(shù)改良動物個體性狀的局限，使品種在多個性狀上同時得到改良，產(chǎn)生更有價值的育種材料。

4 小 結(jié)

本研究采用SSCP 技術(shù)檢測到FSHβ、ESRα、IGF-1和OVR均存在多態(tài)位點(diǎn)，與玫瑰冠雞產(chǎn)蛋性能、蛋品質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析表明，ESRα和IGF-I的AB 型分別是調(diào)控NE300d和AFE 的優(yōu)勢基因型，OVR基因的BB 型是調(diào)控ESS 的優(yōu)勢基因型。FSHβ-ESRα-IGF-1-OVR聚合基因型GP4（AAABABAB）是調(diào)控HU 的優(yōu)勢基因型，聚合基因型GP5（AABBAAAA）的BW、AFE、NE300d均表現(xiàn)優(yōu)勢。以上標(biāo)記均有望作為玫瑰冠雞產(chǎn)蛋性能與蛋品質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。