晉嵐絨山羊多胎性能4 個候選基因的研究

郭慧慧，周勝花，張 麗，趙 鵬，郭宏宇，毛楊毅，李 俊

（山西省農(nóng)業(yè)動物科學(xué)學(xué)院，山西太原 030032）

晉嵐絨山羊是以遼寧絨山羊為父本、呂梁黑山羊為母本雜交選育的絨山羊新品種，具有產(chǎn)絨量高、絨細(xì)度好、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)等特性[1]。通過在山西省境內(nèi)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，晉嵐絨山羊多數(shù)產(chǎn)單胎，平均產(chǎn)羔率在100%～120%，生長速度低于綿羊，其低產(chǎn)羔率已成為制約產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的主要瓶頸之一。由于絨山羊的繁殖力屬于低遺傳力，因此利用分子標(biāo)記輔助選擇可以加快晉嵐絨山羊多胎性狀的選育進(jìn)程，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。

生長分化因子9（Growth Differentiation Factor 9，GDF9）定位于綿羊5 號染色體，是由卵母細(xì)胞分泌的一種生長因子，骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（Bone Morphogenetic Protein 15，BMP15）定位于X 染色體，是一種在卵巢表達(dá)的卵母細(xì)胞衍生因子，兩者同屬于轉(zhuǎn)化生長因子，BMP15與GDF9基因共同作用于卵泡，影響優(yōu)勢卵泡的選擇和閉鎖卵泡的形成，調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖和分化[2-6]。促卵泡素（Follicle Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）是一種由垂體前葉分泌的糖蛋白激素，它與性腺細(xì)胞受體結(jié)合，促使顆粒細(xì)胞增殖，刺激類固醇合成，從而調(diào)節(jié)配子細(xì)胞的發(fā)育和成熟，F(xiàn)SH 由α和β2 個亞基組成，β亞基決定著FSH 的生物活性。FSHβ基因在山羊的繁殖過程中起著重要作用[7]。促性腺素釋放激素受體（Gonadotropin-releasing Hormone Receptor，GnRHR）通過與促性腺激素釋放激素（GnRH）結(jié)合促進(jìn)黃體素和FSH 的合成與釋放，促進(jìn)性腺的生長、成熟，調(diào)控動物的繁殖力，如激素的合成、裝置配體的生成等。抑制GnRH基因及其受體基因的表達(dá)，哺乳動物的生殖活動就會被限制[8]。

已有研究表明，GDF9、BMP15、FSHβ以及GnRHR基因?qū)ρ蚍敝承誀钣兄匾绊?，但在晉嵐絨山羊上尚無相關(guān)研究。因此，本研究以晉嵐絨山羊為研究對象，采用直接測序和SNaPshot 方法分析GDF9、BMP15、FSHβ以及GnRHR基因多態(tài)性與晉嵐絨山羊繁殖性狀之間的相關(guān)性，以期獲得更準(zhǔn)確全面的遺傳信息，為高繁殖力的晉嵐絨山羊品系選育的標(biāo)記輔助選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 171 只晉嵐絨山羊經(jīng)產(chǎn)母羊選自山西晉嵐絨山羊育種中心、晉嵐絨山羊種羊場，其中每胎產(chǎn)雙羔母羊90 只，每胎產(chǎn)單羔母羊81 只，連續(xù)記錄3 年母羊產(chǎn)羔數(shù)。頸靜脈采血2 mL，無菌抗凝管EDTA 抗凝。

1.1.2 主要試劑及儀器 PCR 儀（PT-200 型）購自BIORAD 公司，臺式高速冷凍離心機(jī)（2-16PK 型）購自Sigma 公司，測序儀（3730XL）購自ABI 公司，電泳儀（DYY-6C 型）購自北京市六一儀器廠，GnRH DNA 聚合酶購自Qiagen 公司，SNaPshot 試劑盒：ABI PRISM?SNaPshotTMMultiplex Kit（ABI公司），SAP酶（Fermentas公司）、ExoI 酶和CIP 酶（New England Biolabs,Inc）。

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA 提取 根據(jù)血液基因組DNA 提取試劑盒的方法，對171 只母羊血液進(jìn)行基因組DNA提取，溶于100 μLTris-EDTA（TE）緩沖液中，-80℃凍存。取2 μL DNA 樣本，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 候選基因引物設(shè)計 根據(jù)NCBI 發(fā)布的山羊BMP15基因（登錄號：KY780297）、GDF9基因（登錄號：NC_030814）、FSHβ基因（登錄號：NC_030822）、以及GnRHR基因（登錄號：NC_030813）序列，用Primer5.0 軟件在編碼區(qū)上下游設(shè)計9 對引物，送上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 根據(jù)產(chǎn)羔記錄，隨機(jī)選取雙羔母羊20 只，單羔母羊20 只，擴(kuò)增4 個基因全部編碼區(qū)序列。PCR擴(kuò)增體系25 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，5×Pfu Buffer（含Mg2+）5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，Pfu polymerase（2.5 U/μL）0.5 μL，DNA模板 2 μL，加ddH2O 至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火40 s，72℃延伸30 s，36 個循環(huán)；72℃延伸8 min；4℃保存。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR 產(chǎn)物條帶回收純化后送北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司測序。

1.2.4 SNPs 位點篩選及SNaPshot 分型技術(shù)檢測 利用DNASTAR 軟件對GDF9、BMP15、FSHβ及GnRHR4 個候選基因全部編碼區(qū)進(jìn)行測序結(jié)果的序列拼接，根據(jù)測序峰圖進(jìn)行SNP 位點判讀。在171 只經(jīng)產(chǎn)母羊（雙羔母羊90 只，單羔母羊81 只）大群體中進(jìn)行了SNaPshot 分型技術(shù)檢測[9]，引物信息見表2。

1.2.5 多重PCR 反應(yīng) PCR 反應(yīng)體系10 μL：10×Buffer I 1 μL，dNTP（2.5 umol/L）0.8 μL，Hs Taq polymerase（5 U/μL）0.1 μL，上下游引物（5 umol/L）各2 μL，DNA 模板（10～20 ng/μL）2 μL，加ddH2O 至10 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共10 個循環(huán)，每個循環(huán)下降1℃；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25 個循環(huán)；72℃延伸10 min，取2 μL 上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR 產(chǎn)物4 μL，蝦堿酶（SAP）（1 U/μL）1.33 μL，外切酶Ⅰ（Exo Ⅰ）（20 U/μL ）0.27 μL 進(jìn)行純化，37℃溫浴1.0 h，75℃滅活20 min 。

表1 引物序列信息

表2 SNaPshot 檢測引物序列信息

1.2.6 單堿基延伸 反應(yīng)體系5 μL：純化后擴(kuò)增產(chǎn)物1.2 μL，Primers Mix 2 μL，ABI Mix 0.5 μL，10×Buffer I 0.5 μL，加ddH2O 至5 μL。延伸條件：96℃變性 10 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s，共30 個循環(huán)。延伸產(chǎn)物純化：延伸反應(yīng)產(chǎn)物5 μL 加入1 μL CIP 酶；37℃溫浴1.0 h，75℃滅活15 min。96 孔板中每孔加入分子量內(nèi)標(biāo)和甲酰胺混合液（0.5:8.5）9 μL，PCR 產(chǎn)物1.0 μL；95℃變性3 min，3730XL 測序儀檢測。

1.2.7 統(tǒng)計分析 利用卡方檢驗群體是否處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)。配合下列模型進(jìn)行最小二乘方差分析，比較產(chǎn)羔數(shù)在各個基因型間的差異：

yij=μ+Fi+Gj+eij

其中，yij為產(chǎn)羔數(shù)；μ 為群體均值；Fi為場（次）效應(yīng)值；Gj為基因型效應(yīng)值；eij為隨機(jī)殘差效應(yīng)。采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件中的GLM 過程對BMP15基因和GDF9基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，不同基因型對應(yīng)的產(chǎn)羔數(shù)用最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用Cervus軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）和期望雜合度（He），PIC＜0.25 為低度多態(tài)；0.25＜PIC＜0.5 為中度多態(tài)；PIC＞0.5 為高度多態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 PCR 擴(kuò)增 由圖1 可知，引物P1～P9 的PCR 擴(kuò)增條帶清晰、明亮，無雜帶，產(chǎn)物大小均與預(yù)期一致。

2.2 SNP 位點檢測結(jié)果 4 個候選基因全部編碼區(qū)共篩選出17 個SNPs 位點，其對應(yīng)的氨基酸位置見表3，F(xiàn)SHβ基因2 個外顯子編碼130 個氨基酸，GDF9基因2 個外顯子編碼454 個氨基酸，BMP15基因2 個外顯子編碼395 個氨基酸，GnRHR基因3 個外顯子編碼329 個氨基酸。17 個SNPs 位點中包含11 個錯義突變和6 個同義突變（FSHβ基因5 個SNPs 位點、GDF9基因6 個SNPs位點、BMP15基因3 個SNPs 位點、GnRHR基因3 個SNPs 位點）。

表3 SNP 位點及相應(yīng)編碼氨基酸

2.3 SNaPshot 檢測結(jié)果 根據(jù)各個SNP 位點基因型在單雙羔母羊群體中的分布，選取BMP15基因A735G 位點以及GDF9基因A959C 位點，對171 只經(jīng)產(chǎn)母羊（雙羔母羊90 只，單羔母羊81 只）進(jìn)行了SNaPshot 分型技術(shù)檢測。GDF9基因A959C 位點共檢測到3 種基因型：野生型AA，雜合型AC，突變型CC；BMP15基因G735A 位點共檢測到3 種基因型：野生型GG，雜合型AG，突變型AA。其中GDF9基因編碼區(qū)959 位點的A →C 的突變導(dǎo)致第320 位編碼氨基酸由谷氨酰胺（Q）變成脯氨酸（P）。BMP15基因編碼區(qū)735 位點的G →A 突變?yōu)橥x突變，未導(dǎo)致編碼氨基酸的改變（圖2）。

2.4GDF9基因和BMP15基因的基因型頻率、等位基因頻率、PIC 及He 由表4 可見，該群體GDF9基因A959C 位點A 等位基因頻率高于C 等位基因頻率，A 為優(yōu)勢等位基因；AA 基因型頻率高于AC 和CC，AA 基因型為優(yōu)勢基因型，該位點屬于中度多態(tài)，經(jīng)卡方檢驗，該位點處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。該群體BMP15基因G735A 位點G 等位基因頻率顯著高于A等位基因頻率，G 為優(yōu)勢等位基因；GG 基因型頻率高于AG 和AA，GG 基因型為優(yōu)勢基因型，該位點屬于低度多態(tài)，經(jīng)卡方檢驗，該位點處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)。

表4 GDF9 基因和BMP15 基因的基因型頻率、等位基因頻率、PIC 及He

2.5GDF9基因、BMP15基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 由表5 可知，該晉嵐絨山羊群體中GDF9基因CC、AC 基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于AA 基因型個體，表明GDF9基因A959C 位點的A/C 突變中，C 等位基因與晉嵐絨山羊高產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)；BMP15基因AA、AG 基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG 基因型個體，表明BMP15基因G735A 位點的G/A 突變中，A 等位基因與晉嵐絨山羊高產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。

表5 GDF9 和BMP15 基因不同基因型對產(chǎn)羔性能的影響

3 討 論

3.1GDF9基因與山羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性 在山羊卵巢中，GDF9mRNA 和蛋白在卵泡期和黃體期均有表達(dá)。GDF9基因中的多個突變對綿羊的排卵率有影響[10]，其中有4 個突變確定對綿羊的繁殖性能有影響[11-12]。在GDF9基因959 位點，基因型分布在高產(chǎn)和中、低產(chǎn)羊品種中呈現(xiàn)明顯的差異[3,13-14]。Wang 等[13]報道959 位點突變對陜北白絨山羊的產(chǎn)羔數(shù)起著非常重要的作用。在濟(jì)寧青山羊中CC、AC 基因型的產(chǎn)羔率極顯著高于AA 基因型[3]。Zhao 等[14]也報道GDF9基因Q320P 在內(nèi)蒙古絨山羊世代單羔母羊和產(chǎn)雙羔母羊中差異表達(dá)。本研究中，晉嵐絨山羊群體GDF9基因編碼區(qū)959 位點存在多態(tài)，檢測到3 種基因型：AA、AC、CC，該突變使得GDF9基因第320 位編碼氨基酸由谷氨酰胺變成脯氨酸。該位點的CC、AC 基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)極顯著高于AA 基因型個體，表明等位基因C 與晉嵐絨山羊高產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。

3.2BMP15基因與山羊產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性BMP15與GDF9同屬于TGF-β超家族成員，對卵泡發(fā)育起重要調(diào)控作用，BMP15與卵巢自身生成的GDF9協(xié)同作用于卵泡，以自分泌或旁分泌形式對優(yōu)勢卵泡的發(fā)育及卵母細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響[15]。在人、小鼠、大鼠和綿羊卵泡發(fā)育前期，卵母細(xì)胞中均有BMP15基因的表達(dá)[16]。Yan 等[17]研究表明，BMP15基因?qū)Υ菩孕∈蟮姆敝承誀钣兄匾绊憽MP15基因突變純合雌性個體的每窩產(chǎn)仔數(shù)和每月窩數(shù)都顯著低于BMP15突變雜合雌性個體。Otsuka 等[18]確定了BMP15的兩個主要作用，其一是通過抑制顆粒細(xì)胞中FSH 受體的表達(dá)，進(jìn)而抑制FSH 的表達(dá)；其二是通過促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)早期卵泡的發(fā)育。國外研究表明BMP15外顯子上存在5 個影響綿羊繁殖性能的SNPs 位點：FecXH（C67T）、FecXI（T92A）、FecXB（G100T）、FecXL（G321A）、FecXG（C718T），但在本實驗群體中均未發(fā)現(xiàn)以上突變。關(guān)于BMP15基因G735A 突變位點的報道很少，該位點是由Ahlawat 等[19]2013 年首先在印度本土山羊品種中檢測到，但該突變在印度本土高、低產(chǎn)山羊中差異不顯著。本研究中，晉嵐絨山羊群體BMP15基因編碼區(qū)735 位點存在多態(tài)，檢測到3 種基因型：GG、AG、AA，該突變未導(dǎo)致編碼氨基酸改變。該位點的AA、AG 基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于GG 基因型個體，表明等位基因A 與晉嵐絨山羊高產(chǎn)羔數(shù)呈顯著正相關(guān)。

3.3GDF9基因和BMP15基因的聯(lián)合效應(yīng) Hanrahan等[20]報道BMP15基因和GDF9基因?qū)d羊排卵數(shù)具有聯(lián)合加性效應(yīng)，2 個基因的基因型均為突變雜合子時，綿羊具有更高的排卵數(shù)。Liao 等[21]、Alexandra 等[22]報道當(dāng)BMP15和GDF9基因一起表達(dá)時，BMP15基因加工和分泌功能消失，GDF9基因加工和分泌功能嚴(yán)重受損。因此，如果綿羊BMP15基因突變純合和GDF9基因突變純合同時發(fā)生，其排卵數(shù)更低。由此可推測BMP15基因編碼區(qū)735 位點的突變雖未引起編碼氨基酸改變，但有可能是與GDF9基因進(jìn)行聯(lián)合作用，進(jìn)而影響晉嵐絨山羊的產(chǎn)羔率。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在該群體中GDF9基因和BMP15基因與晉嵐絨山羊產(chǎn)羔率顯著相關(guān)，初步認(rèn)為GDF9基因和BMP15基因是影響晉嵐絨山羊繁殖性能的主效基因，可擴(kuò)大群體規(guī)模對以上兩位點進(jìn)行進(jìn)一步驗證，若確定此位點是影響晉嵐絨山羊產(chǎn)羔率的主效基因，可以作為分子標(biāo)記對晉嵐絨山羊進(jìn)行輔助育種，同時初步排除FSHβ基因和GnRHR基因突變對晉嵐絨山羊多胎性能影響的可能性。