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      基于50K SNP 芯片技術(shù)對金華豬和嵊縣花豬繁殖性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

      2020-07-24 10:45:30羅才玉章嘯君徐寧迎郭曉令
      中國畜牧雜志 2020年7期
      關(guān)鍵詞:花豬金華染色體

      蔡 薇,羅才玉,項 云,章嘯君,徐寧迎,郭曉令*

      (1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310058;2.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江金華 321017)

      繁殖性狀是畜牧生產(chǎn)中最重要的經(jīng)濟性狀之一,母豬的繁殖性狀將直接影響豬肉產(chǎn)量和經(jīng)濟效益[1]。在現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中,提高總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)是養(yǎng)豬的主要目標(biāo)之一[2]。由于繁殖性狀的遺傳機制較為復(fù)雜,遺傳力較低且表型僅在母豬后期才可體現(xiàn)[1,3],因此利用傳統(tǒng)育種方法所獲得的遺傳進展十分緩慢。近年來,隨著分子生物技術(shù)和豬高密度SNP 芯片不斷發(fā)展,利用全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)技術(shù)能夠更準(zhǔn)確地定位QTL 區(qū)域及候選基因。從豬的數(shù)量性狀座位(QTL)數(shù)據(jù)庫(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/SS/index)中可以發(fā)現(xiàn),截至到2019 年8 月,已有657 篇文獻報道了與豬678 個性狀相關(guān)的29 045 個QTLs。迄今為止,已有GWAS 用于豬繁殖性狀分析,如豬的乳頭數(shù)[4]、排卵率[5]、產(chǎn)活仔數(shù)[2]、產(chǎn)死仔數(shù)和木乃伊數(shù)[2,6]。GWAS 結(jié)果發(fā)現(xiàn)17 個影響仔豬活仔數(shù)的SNPs[7]且VRTN被認(rèn)為最可能與乳頭數(shù)相關(guān)的基因[8]。然而目前對地方豬種經(jīng)濟性狀的GWAS 研究較少,因此,本研究利用浙江省地方豬種金華豬和嵊縣花豬群體,測定總產(chǎn)仔數(shù)(TNB)和產(chǎn)活仔數(shù)(NBA),采用豬50K SNP 芯片技術(shù)獲得的基因型對2 個群體進行獨立GWAS 分析及META 分析,探究顯著影響TNB 和NBA 的SNP 位點,為主效基因的定位和選擇奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 實驗動物 實驗動物采用金華家農(nóng)兩頭烏種豬有限公司及金華市農(nóng)科所的255 頭金華豬,314 頭嵊縣花豬來自紹興市嵊縣花種豬有限公司,2 個群體均是在產(chǎn)母豬,個體飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)相同。

      1.2 表型數(shù)據(jù) 2 個群體的2 個繁殖性狀(TNB 和NBA)數(shù)據(jù)來自于金華家農(nóng)兩頭烏種豬有限公司、金華市農(nóng)科所和紹興市嵊縣花種豬有限公司。截止2019 年7 月底,最終收集了實驗動物中205 頭金華豬和174 頭嵊縣花豬TNB 和NBA 的表型數(shù)據(jù)。

      1.3 基因分型和質(zhì)量控制 采用豬耳緣靜脈采血的方法采取血液,將血液滴于血斑卡,送至紐勤生物科技(上海)有限公司提取DNA,將質(zhì)檢合格的DNA 樣品利用Illumina 平臺的GGP Porcine50K SNP 芯片進行基因分型。利用PLINK v1.09 軟件對基因型數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制,剔除檢出率<90%、個體基因型缺失率>0.1、最小等位基因頻率(MAF)<0.05 以及哈代溫伯格平衡P<1×10-6的SNPs。

      1.4 群體結(jié)構(gòu)分析 在進行GWAS 分析時,群體分層可以導(dǎo)致分析結(jié)果出現(xiàn)假陽性[9]。PCA 方法主要用于遺傳學(xué)的聚類分析,它根據(jù)遺傳差異將個體分為不同的亞組,以探索群體的遺傳結(jié)構(gòu)[10-12]。因此,本研究將此方法應(yīng)用于群體分層分析。本研究利用GCTA 軟件對有效SNP 進行主成分分析(PCA),獲得基因組數(shù)據(jù)特征值和特征向量,并用R 程序做PCA 圖。

      1.5 統(tǒng)計分析 本研究采用GEMMA 軟件進行關(guān)聯(lián)分析。GEMMA 是一個用于GWAS 分析的經(jīng)典軟件,混合線性模型(MLM)又能將群體結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系分別作為固定效應(yīng)和隨機效應(yīng)加在關(guān)聯(lián)分析模型中,以此來控制關(guān)聯(lián)分析中的假陽性,因此,本實驗采用MLM 進行關(guān)聯(lián)分析,模型如下:

      y=Wα+xβ+μ+ε

      其中,y 為對應(yīng)的繁殖性狀表型值,n 個樣本對應(yīng)n 個性狀;W 是固定效應(yīng)矩陣;α是包含截距在內(nèi)的相應(yīng)系數(shù);x 表示SNP 基因型;β表示標(biāo)記的效應(yīng)大?。沪淌请S機效應(yīng);ε表示殘差。META 分析時,將豬種的不同作為固定效應(yīng)進行分析。本研究采用Bonferroni 多重檢驗方法確定關(guān)聯(lián)顯性閾值,基因組水平顯著閾值為0.05/有效SNP 位點數(shù)量,染色體水平顯著閾值為1/有效SNP 位點數(shù)量。

      1.6 候選基因注釋 根據(jù)GWAS 的結(jié)果,針對顯著SNP位點的名稱和所在基因組位置,通過Ensembl(http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/info/Index)和NCBI(hppt://www.ncbi.nim.nih.gov/)上的信息,在其上、下游尋找候選基因,并結(jié)合文獻報道對候選基因進行功能注釋。

      2 結(jié)果

      2.1 表型數(shù)據(jù)分析 如表1 所示,金華豬性狀TNB 的平均值為10.17,NBA 平均值為9.18。嵊縣花豬性狀TNB 平均值為12.35,性狀NBA 的平均值為12.08。META 分析性狀TNB 的平均值為11.17,性狀NBA 的平均值為10.86。

      2.2 質(zhì)控后的有效SNP 數(shù) 如表2 所示,質(zhì)控后,金華豬群體得到28 172 個有效SNPs;嵊縣花豬群體得到25 763 個有效SNPs;用于META 分析的金華豬和嵊縣花豬混合群體最終得到23 762 個有效SNPs。

      表1 金華豬、嵊縣花豬和META 分析TNB 和NBA 性狀的描述統(tǒng)計

      表2 質(zhì)控后有效個體數(shù)和有效SNP 數(shù)量表

      2.3 群體結(jié)構(gòu)分析 如圖1 所示,金華豬和嵊縣花豬群體各自相對集中,可以清楚地分為2 組,這表明金華豬群體內(nèi)以及嵊縣花豬群體內(nèi)不存在明顯的群體分層,而金華豬和嵊縣花豬則被明顯地分為2 個群體。在后續(xù)的META 分析中,將PCA 結(jié)果的前3 列主成分作為協(xié)變量加入關(guān)聯(lián)模型以此校正群體分層的影響。

      2.4 GWAS

      2.4.1 金華豬GWAS 結(jié)果 如表3 所示,對于TNB,共檢測到11個顯著關(guān)聯(lián)的SNP,有5個SNP達到基因組顯著水平,其中有3 個SNP 位于2 號染色體,2 個SNP 位于14 號染色體,達到染色體水平顯著的6 個SNP 分別位于2、5、6、14 號染色體。這11 個SNP 分別鄰近或座落于

      SPINK9、NANOS1、SH3TC2、GRK5、ARHGEF37、PPP2R2B、HOOK1、E2F7基因。對于NBA,共檢測到9 個顯著關(guān)聯(lián)的SNP,發(fā)現(xiàn)8 個SNP 和與TNB 相關(guān)顯著SNP 相同,分別鄰近或座落于NANOS1、SPINK9、SH3TC2、ARHGEF37、PPP2R2B基因,還有1 個SNP位點ASGA0012858位于2號染色體,鄰近于PDE6A基因。

      2.4.2 嵊縣花豬GWAS 結(jié)果 在嵊縣花豬群體中,共檢測到1 個與TNB 和NBA 都相關(guān)的SNP(表4),該SNP 位于9 號染色體,鄰近于PHTF2基因。金華豬、嵊縣花豬以及META 分析TNB 和NBA 的GWAS 結(jié)果如圖2 所示。

      2.4.3 META 分析GWAS 結(jié)果 在金華豬和嵊縣花豬混合群體中,共鑒別到1 個與TNB 相關(guān)、達到基因組水平顯著的SNP 位點,17 個達到染色體水平顯著的SNP位點(表5)。其中最顯著SNP 位點WU_10.2_14_140199680 的P值為1.58E-10,鄰近于NANOS1基因。另外有14 個SNP 位點位于5 號染色體,這些SNP 鄰近或座落于INTS13、GUCY2C、GRIN2B、FAM234B、BCAT1、AEBP2、HELB、SRGAP1、SLC35E3、KRAS基因。SNP 位點H3GA0016291 和ALGA0031876位于6 號染色體,鄰近于MIIP基因。對于NBA,共鑒別到3 個SNP,其中1 個達到基因組顯著水平的SNP 和TNB 達到顯著的SNP 位點相同,鄰近基因為NANOS1。另外2 個達到染色體水平顯著的SNP 分別位于2 號和5 號染色體,分別鄰近于SPINK9、CRY1基因。金華豬、嵊縣花豬、META 分析TNB 和NBA關(guān)聯(lián)分析曼哈頓圖如圖3~5 所示。

      3 討 論

      GWAS 是鑒定家畜復(fù)雜性狀的一種有效方法。在豬生產(chǎn)中,GWAS 被用來鑒定與生產(chǎn)相關(guān)性狀的候選基因。本研究對金華豬和嵊縣花豬2 個群體的TNB 和NBA 分別做了獨立GWAS 和META 分析。在GWAS 分析中,采用Bonferroni 校正多重檢驗確定顯著閾值,在金華豬、嵊縣花豬和META 分析群體中,分別檢測到20、2、21個SNP 達到基因組或染色體顯著水平。群體分層會對GWAS 結(jié)果的準(zhǔn)確性造成比較大的影響[13]。本研究群體來自相同的農(nóng)場,遺傳結(jié)構(gòu)較為相似。另外,PCA 圖和QQ 圖都顯示本實驗群體沒有明顯的群體分層,這表示本研究的GWAS 結(jié)果是可靠的。

      表3 金華豬TNB 和NBA 顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點

      表4 嵊縣花豬TNB 和NBA 顯著關(guān)聯(lián)的SNP 位點

      表5 META 分析TNB 和NBA 顯著關(guān)聯(lián)SNP 位點

      根據(jù)金華豬群體的GWAS 結(jié)果,發(fā)現(xiàn)了5 個基因(SPINK9、NANOS1、SH3TC2、ARHGEF37、PPP2R2B)同時影響TNB 和NBA,分布于2 號和14 號染色體上。其中,SPINK9 是一種Kazal 型絲氨酸蛋白酶抑制劑,在手掌和足底特異性表皮分化中發(fā)揮作用[14]。NANOS1位于14 號染色體,是維持成年斑馬魚卵母細胞生成所必需的基因[15],也有研究表明,NONOS1-PUMILIO2 復(fù)合物可能調(diào)節(jié)人生殖細胞染色體內(nèi)的mRNA 翻譯[16]。SH3TC2基因的突變可能導(dǎo)致周圍神經(jīng)炎癥[17]。對于ARHGEF37基因的研究目前較少,有文獻表明ARHGEF37 是一種參與內(nèi)吞作用的調(diào)節(jié)蛋白[18]。PPP2R2B 是一種在整個大腦神經(jīng)元中廣泛表達的蛋白質(zhì),它調(diào)節(jié)微管相關(guān)蛋白tau 和其他底物的蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性[19]。位于5 號和6 號染色體的E2F7和HOOK1是僅影響TNB 的候選基因。E2F7屬于E2F 家族成員。大量研究表明,E2F 家族成員具有激活和抑制細胞增殖、凋亡和分化過程中許多必需基因轉(zhuǎn)錄的功能[20]。Li 等[21]研究發(fā)現(xiàn)E2F7 是對控制細胞增殖起重要作用的轉(zhuǎn)錄抑制因子,和E2F8 的協(xié)同功能對細胞存活和胚胎發(fā)育起著重要作用。研究表明,HOOK1 功能的喪失導(dǎo)致精子細胞內(nèi)微管結(jié)構(gòu)異位,并導(dǎo)致產(chǎn)生異常的精子頭部形狀[22]。位于14 號染色體的GRK5基因被認(rèn)為是影響中國漢族人2 型糖尿病的一個候選基因[23]。影響NBA 的候選基因PDE6A的突變引起小鼠隱形視網(wǎng)膜色素變性[24]。

      根據(jù)嵊縣花豬GWAS 結(jié)果,發(fā)現(xiàn)SNP 位點MARC 0001353 與TNB 和NBA 都相關(guān),鄰近基因為PHTF2,PHTF2 主要在肌肉中表達[25],定位于細胞核并參與DNA 結(jié)合,也可能在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起作用。嵊縣花豬群體GWAS 結(jié)果發(fā)現(xiàn)的顯著SNP 位點較少,分析可能是由于以下2 點原因造成:一是嵊縣花豬群體規(guī)模有限,導(dǎo)致表型分離不明顯;二是采用Bonferroni 校正多重檢驗校正得到的顯著水平過于嚴(yán)格,閾值過高,導(dǎo)致達到閾值的SNP 位點較少。

      基于2 個群體的META 分析尋找到的候選基因為NANOS1、INTS13、GUCY2C、GRIN2B、MIIP、FAM234B、SPINK9、BCAT1、AEBP2、HELB、SRGAP1、SLC35E3、KRAS、CRY1。其中NANOS1和SPINK9基因在金華豬和嵊縣花豬獨立GWAS 結(jié)果中也是候選基因,根據(jù)GWAS 結(jié)果以及基因注釋,NANOS1很可能是影響TNB 和NBA 的候選基因。新鑒定出的顯著SNP 位點多位于5 號染色體,AEBP2基因是一種已知的PRC2(多細胞生物中可遺傳基因沉默的關(guān)鍵介質(zhì))輔因子,其在體外已被證明可刺激PRC2 活性。研究表明,AEBP2基因可能間接地影響胚胎發(fā)育[26]。Zhang 等[27]研究發(fā)現(xiàn)位于5 號染色體的SRGAP1基因與豬耳大小有關(guān)?;诨蚬δ茏⑨尳Y(jié)果,其余候選基因多與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育以及癌癥的發(fā)生有關(guān)。

      由于母豬的各繁殖性狀受多個因素的影響,存在種間差異,樣本量也一定程度上影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性,因此不同的品種定位的顯著SNP 位點各有不同。本研究定位的基因?qū)NB 和NBA 是否有影響及如何影響有待進一步探索,為后期的驗證研究提供了新的方向和思路。

      4 結(jié) 論

      本研究對205 頭金華豬和174 頭嵊縣花豬的TNB和NBA 進行獨立GWAS 和META 分析,金華豬和嵊縣花豬分別鑒定到20、2 個顯著SNP,META 分析鑒定到21 個顯著SNP。共發(fā)現(xiàn)22 個候選基因,通過基因注釋發(fā)現(xiàn)NANOS1、E2F7、AEBP2是最有可能影響TNB 和NBA 的候選基因。

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