鵝星狀病毒SYBR Green I熒光定量RT-PCR方法的建立

白彩霞 張達 趙靚 楊侃侃 王小朋 李新路 李錦春 李永東 王勇

摘要：為建立快速檢測鵝星狀病毒（GAstV）的方法，本研究根據GenBank中GAstV ORF2基因序列設計1對特異性引物，構建重組質粒pMD19-T-GAstV，以其作為標準品建立了GAstV的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法。優(yōu)化其反應條件及體系，進行特異性、敏感性和重復性試驗以及臨床樣本檢測。試驗結果顯示，除GAstV外，禽白血病病毒（ALV）、血清4型禽腺病毒（FAdV-4）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）和雞傳染性貧血病病毒（CIAV）等常見禽病病原利用該方法檢測均呈陰性，表明其特異性良好;建立的熒光定量RT-PCR檢出的最低模板含量為1 μl 3.75×101拷貝，敏感性較高;組內和組間重復性試驗變異系數(shù)均小于1 %。利用該方法對來自安徽地區(qū)的32份臨床樣品進行檢測，陽性檢出率為43.75%，常規(guī)PCR方法陽性檢出率為18.75%，陽性檢出符合率100%，表明該方法可用于臨床樣品檢測。該方法的建立為臨床樣品中GAstV的快速高效檢測提供了技術支持。

關鍵詞：鵝星狀病毒;SYBR Green I 熒光定量RT-PCR;檢測

中圖分類號：S858.33文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）03-0634-05

Development and application of SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR assay for detection of goose astrovirus

BAI Cai-xia1，ZHANG Da1，ZHAO Liang1，YANG Kan-kan1，WANG Xiao-peng1，LI Xin-lu1，LI Jin-chun1，LI Yong-dong2，WANG Yong1

（1.College of Animal Science and Technology， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China;2.Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention， Ningbo 315010， China）

Abstract：In order to rapidly detect the goose astrovirus （GAstV）， the SYBR Green I fluorescence quantitative RT-PCR method was established. Firstly， a pair of specific primers was designed based on the ORF2 gene sequence of the GAstV in GenBank. Secondly， the recombinant plasmid pMD19-T-GAstV was constructed and used as a standard template to generate the standard curve. The reaction conditions and reaction system were optimized， the specificity， sensitivity and reproducibility of the assay were tested. Moreover， the established assay was used in clinical samples detection. The results showed that the detection results of fowl adenovirus serotype 4（FAdV-4）， infectious laryngotracheitis virus（ILTV）， avian leukosis virus（ALV）， chicken infectious anemia virus（CIAV） and other common avian pathogens were negative except the GAstV. It indicated that the assay had good specificity. The lowest template content detected by fluorescence quantitative RT-PCR assay was 3.75×101 copies per milliliter. The variation coefficients in the repeatability test were less than 1%. Thirty-two clinical samples from Anhui province were tested using this assay. The positive detection rate was 43.75%， the positive rate of conventional PCR was 18.75%， and the coincidence rate was 100%. In conclusion， the established assay provides technical support for the rapid and efficient detection of GAstV in clinical samples.

Key words：goose astrovirus（GAstV）;SYBR Green I flucrescence quantitative RT-PCR;detection

星狀病毒（Astroviruses，AstV）屬于星狀病毒科，為無囊膜、單股正鏈RNA病毒[1]。基因組全長6.9～7.9 kb，包括5′UTR，3個開放閱讀框ORF1a、ORF1b、ORF2，3′UTR及多聚腺苷酸（polyA）尾[2]?？筛鶕腥舅拗鞯牟煌譃椴溉閯游镄菭畈《竞颓蓊愋菭畈《?。哺乳動物星狀病毒包括人類、貓、豬、羊和水貂星狀病毒;禽類星狀病毒包括雞、鴨、火雞星狀病毒及禽腎炎病毒[3-5]。2017年中國多個省份的鵝養(yǎng)殖場暴發(fā)一種以內臟和關節(jié)出現(xiàn)尿酸鹽沉積為主要臨床特征的新發(fā)疾病，該病造成雛鵝的大量死亡，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來巨大的經濟損失。該病主要發(fā)生在5～20日齡的雛鵝，死亡率最高可達50%[6-7]?；疾‰r鵝精神沉郁，采食量減少，關節(jié)腫大;尸檢可見內臟器官大量尿酸鹽沉積，尤其是肝臟、心臟及腎臟[8]。Niu等首次從病鵝組織中分離出一種新型的鵝源星狀病毒（Goose astrovirus，GAstV）[6-7]。

目前尚無針對該病的治療措施及疫苗，防治重點在于疫情的檢測和控制。因此建立一種快速、準確和省時的檢測方法對疫情的防控尤為重要。然而目前檢測GAstV常用方法是PCR，與熒光定量RT-PCR相比該方法具有交叉污染且耗時長等缺點，不適用于大量臨床樣品的檢測[9-10]。而SYBR Green I熒光定量PCR作為一種通用的病原體檢測技術，具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，能在較短時間內完成病原體檢測，已被廣泛用于動物疾病的臨床診斷。因此，本研究旨在建立一種基于SYBR Green I的實時熒光定量RT-PCR的快速檢測GAstV的方法，為GAstV的臨床診斷和流行病學調查提供技術支持。

1材料與方法

1.1病毒及臨床樣品

禽白血病病毒（ALV）、血清4型禽腺病毒（FAdV-4）、雞傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、雞傳染性貧血病病毒（CIAV）均由本實驗室保存;GAstV感染的鵝心、肝和腎等樣品采用文獻[6]的方法檢測為GAstV陽性后由本實驗室保存;疑似GAstV感染的32份心、肝和腎臨床樣品于2018年采自安徽省不同地區(qū)養(yǎng)殖場。

1.2主要試劑

pMD19-T載體、DL600 DNA marker、rTaq DNA聚合酶、Solution I和TB GreenTM Premix DimerEraserTM （Perfect Real Time） 購自 TaKaRa公司，質粒提取試劑盒購自AXYGEN公司，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司，DH5α感受態(tài)細胞、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和FastQuant RT Kit（with gDNase）購自TIANGEN公司。

1.3引物的設計與合成

根據GenBank登錄的GAstV病毒株（MH052598.1）ORF2閱讀框堿基序列，利用Primer Premier5.0軟件設計1對特異性引物（F：5′-CGATGAGAAGGAGCAACACA-3′，R：5′-CAGAATTTGAAGCAGCACCA-3′），預期擴增片段為182 bp。引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

1.4DNA/RNA的提取及cDNA的合成

取適量鑒定為GAstV陽性的心、肝和腎等組織加入含青霉素和鏈霉素各1 000 IU/ml的PBS用研缽充分碾磨，置于-80 ℃冰箱反復凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清液，置于-80 ℃冰箱待用。利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取FAdV-4、ILTV病毒基因組DNA，ALV、CIAV、GAstV病毒基因組RNA，反轉錄為cDNA后與上述病毒DNA分別置于-20 ℃保存。

1.5重組質粒標準品的制備

以提取的鑒定為GAstV陽性的cDNA為模板，采用引物F/R進行常規(guī)RT-PCR擴增。反應條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化擴增產物，將其克隆于pMD19-T中，構建重組質粒pMD19-T-GAstV，由南京擎科生物科技有限公司測序鑒定。重組質粒使用紫外分光光度計測定OD260/OD280值，按照拷貝數(shù)計算公式（質粒濃度×6.02×1023）/（109×基因組長度×660），計算重組質?？截悢?shù)。

1.6熒光定量RT-PCR方法的建立與優(yōu)化

采用TB GreenTM Premix DimerEraserTM （Perfect Real Time） 試劑盒推薦的25 μl反應體系，以出現(xiàn)最小Ct值和最高熒光值以及不出現(xiàn)非特異擴增產物為標準，采用方陣法分別對引物濃度（0.2～1.0 μmol/L）、退火溫度（50～60 ℃）、延伸時間（20～32 s）等反應條件進行優(yōu)化，確定最佳反應條件及體系。

1.7標準曲線和熔解曲線的建立

以10倍倍比稀釋為8個梯度（1 μl 3.75×101～3.75×108拷貝）的標準質粒為模板，同時設陰性對照（ddH2O）。用優(yōu)化后的熒光定量RT-PCR體系及程序進行擴增，每個標準品和陰性對照做3個重復，建立標準曲線。待反應結束后，建立熔解曲線。結果判定標準如下：Ct值≤30并出現(xiàn)特異的擴增曲線和較為一致的熔解曲線，即判定結果為“陽性”;被檢樣品3035判定為“陰性”。

1.8特異性試驗

以提取的FAdV-4、ILTV、ALV、CIAV的DNA/cDNA為模板，采用優(yōu)化后的熒光定量RT-PCR條件進行擴增，同時設置陰性對照（ddH2O）及陽性對照（GAstV），驗證該方法的特異性。

1.9敏感性試驗

用8個稀釋梯度（1 μl 3.75×101～3.75×108拷貝）的標準品為模板，采用優(yōu)化后的熒光定量RT-PCR體系及程序進行擴增，檢測該方法可檢出的最低模板拷貝數(shù)。同時用常規(guī)PCR方法對相同稀釋梯度的模板進行擴增，將2種方法的檢測結果進行對比，驗證本試驗建立的熒光定量RT-PCR方法敏感性。

1.10重復性試驗

用3個稀釋梯度（1 μl 3.75×108、1 μl 3.75×105、1 μl 3.75×102）的標準質粒為模板，每個梯度設置3個重復，在同一時間或者不同時間段檢測3次，進行組內和組間重復性試驗，計算變異系數(shù)以驗證該方法的重復性。

1.11臨床樣品的檢測

根據基因組提取試劑盒使用說明書提取32份臨床樣品基因組，采用本研究建立的熒光定量RT-PCR及常規(guī)PCR方法對32份臨床樣品進行檢測，比較二者的檢測結果，并計算2種檢測方法的符合率。

2結果與分析

2.1重組質粒標準品的鑒定

利用F/R引物，對GAstV陽性病料的基因組cDNA進行PCR擴增，擴增出約182 bp的單一特異性片段，與預期結果一致（圖1）。將該目的基因片段克隆至pMD19-T載體中構建重組質粒，質粒測序結果與目的片段序列一致，表明pMD19-T-GAstV重組質粒構建正確。

M：DL600 DNA marker;1：陰性對照;2：GAstV RT-PCR產物。

2.2熒光定量RT-PCR反應條件優(yōu)化

經優(yōu)化后確定最佳反應體系為（25.00 μl）：TB Green Premix DimerEraser（2×）12.50 μl，上游引物、下游引物（10 mmol/L）各0.75 μl，模板2.00 μl，加入ddH2O補足至25.00 μl。最佳反應條件：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。熔解曲線：65 ℃以0.5 ℃/s升至95 ℃。

2.3標準曲線及熔解曲線分析結果

用建立的熒光定量RT-PCR對1 μl 3.75×101拷貝至3.75×108拷貝梯度的GAstV陽性質粒標準品檢測，繪制的標準曲線Ct值與標準質粒含量呈良好線性關系（圖2A）。相關標準曲線方程：Y=-3.065x+33.738，擴增效率（E）=105%，相關系數(shù)（r）=0.993。熔解曲線顯示，熔解溫度（Tm）在84.5 ℃時出現(xiàn)特異性單峰，無引物二聚體及非特異性產物（圖2B）。

2.4特異性試驗結果

利用本研究建立的熒光定量RT-PCR方法對幾種臨床常見禽病病原進行特異性檢測，結果顯示，僅GAstV出現(xiàn)特異性擴增，其他病原及陰性對照均未出現(xiàn)任何擴增曲線（圖3）。表明該方法特異性良好。

2.5敏感性試驗結果

敏感性試驗結果顯示，常規(guī)PCR可檢測質粒標準品的最低含量為1 μl 3.75×103 拷貝 （圖4A），而熒光定量RT-PCR檢測質粒標準品的最低含量為1 μl 3.75×101拷貝（圖4B），熒光定量RT-PCR的敏感性是常規(guī)PCR的100倍。表明本試驗建立的熒光定量RT-PCR敏感性較高。

A：熒光定量RT-PCR;B：常規(guī) PCR。1～8： 1 μl 3.75×108 ～3.75×101拷貝;9：陰性對照。

2.6重復性試驗結果

利用本研究建立的方法進行重復性試驗，結果顯示，該方法的組內和組間變異系數(shù)均小于1.0%（表1）。表明本研究建立的熒光定量RT-PCR方法有較好的重復性。

2.7臨床樣品檢測結果

在32份疑似GAstV感染病料中，熒光定量RT-PCR檢出陽性樣品14份，陽性率為43.75%，常規(guī)PCR檢出陽性樣品6份，陽性率為18.75%，兩者符合率為100%。表明本研究建立的熒光定量RT-PCR檢測方法敏感性更高，可適用于臨床檢測。

3討論

截至目前，中國山東、江蘇、安徽、河南、遼寧和廣東等地區(qū)鵝養(yǎng)殖場陸續(xù)出現(xiàn)一種以雛鵝痛風為主要癥狀的急性傳染病。先前有研究者指出該病的發(fā)生可能是由于超量高蛋白高鈣飼料的使用導致[11-12]，但實踐證明，更換低蛋白飼料后，疫情并未得到改善。直至GAstV被成功分離鑒定[7]，才確定真正病因。迄今為止對GAstV致病性及病理機制尚不清楚，因此，建立特異敏感的檢測技術，可為后期GAstV的感染機制和致病機理研究奠定基礎。

分子生物學技術檢測病毒性傳染病已廣泛應用于臨床診斷[13-15]。實時熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一項新的檢測技術，在動物疾病的檢疫、基因表達分析等各種領域得到廣泛的應用[16]。與常規(guī)PCR相比，具有快速、靈敏、簡便的優(yōu)點[17]。除此之外，還能夠顯著減少試驗過程中的污染及對人體有致癌危害的EB的使用。該檢測技術包括SYBR Green染料法和TaqMan探針法。TaqMan探針需要合成標記有熒光素的探針，成本較高。而SYBR Green是一種結合于雙鏈DNA的熒光染料，在熒光定量PCR反應過程中與擴增產物結合釋放熒光信號，通過儀器實時監(jiān)測，具有靈敏度高、重復性好、操作簡單和可定量分析等優(yōu)點，已成為病毒檢測的重要方法。Yuan等[9]建立了TaqMan探針法檢測GAstV的實時熒光定量RT-PCR方法，需合成針對性很強的核酸探針，成本較高。本研究建立的方法設計簡單，不需要設計探針，更加簡便，通過熔解曲線分析即可區(qū)分非特異性擴增，而且SYBR Green I染料成本低，可通過計算機軟件自動計算定量結果，不需要普通PCR后的電泳檢測，操作更加簡單、省時。

本研究根據GAstV ORF2基因保守序列設計引物，對已鑒定為GAstV陽性的病料進行普通PCR檢測、序列測定及分析，結果顯示擴增的目的片段條帶單一且與預期片段大小相符，熔解曲線呈現(xiàn)特異性良好的單峰，確定所用引物具有良好的特異性，保證了后續(xù)建立檢測方法的準確性。在該引物的基礎上建立基于SYBR Green I染料法的GAstV 熒光定量RT-PCR檢測方法。有資料報道，擴增效率小于105%、決定系數(shù)大于0.98、△Ct值變異系數(shù)小于10%是評估一種熒光定量PCR標準曲線質量的主要參數(shù)[18]，精確靈敏度的確定需要滿足這3個前提條件。本研究建立的方法擴增效率為105%，相關系數(shù)為0.993，精確靈敏度為1 μl 3.75×101拷貝，表明具有良好的線性關系;與禽類常見病原無交叉反應，表明特異性較好;組內和組間變異系數(shù)小于1%，表明具有良好的重復性。

綜上所述，本研究建立的SYBR Green I熒光定量RT-PCR檢測方法，特異性強、靈敏性高、重復性好，能夠實現(xiàn)對樣品的實時動態(tài)檢測，自動分析結果，避免了空氣中的交叉污染，可在短時間內得出檢測結果。該方法的建立為GAstV流行病學調查以及臨床診斷提供了有效的技術手段。

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（責任編輯：陳海霞）