紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)信息分析

李喜蓮 郭建林 李倩 施偉達(dá) 黃振遠(yuǎn) 顧志敏

摘要：對(duì)紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并開發(fā)引物通過(guò)PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳檢測(cè)，進(jìn)行了引物多態(tài)性和通用性分析。從67 369條Unigenes中共檢測(cè)到22 727個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）位點(diǎn)，并對(duì)包含SSR序列的Unigenes進(jìn)行功能注釋。結(jié)果表明，紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星序列的類型較為豐富，其中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率較多，分別占總SSR出現(xiàn)頻率的52.67%和44.25%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率較少，分別占總SSR出現(xiàn)頻率的2.62%、0.23%和0.24%。SSR重復(fù)類型共有68種，其重復(fù)次數(shù)的范圍為5～84次。篩選出SSR引物5對(duì)，對(duì)浙江本地及臺(tái)灣2個(gè)群體的60個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，每對(duì)引物平均產(chǎn)生5.6個(gè)多態(tài)性片段。本研究結(jié)果為深入開發(fā)紅螯螯蝦功能性SSR標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)，也為開展紅螯螯蝦分子標(biāo)記輔助選育提供支持。

關(guān)鍵詞：紅螯螯蝦;轉(zhuǎn)錄組;SSR;位點(diǎn)信息

中圖分類號(hào)：S917.4?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2020）07-0207-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.043

Abstract： The transcriptome sequencing data of the red claw crayfish （Cherax quadricarinatus） was analyzed，and the primers were developed by PCR amplification and capillary electrophoresis，the primer polymorphism and versatility analysis were carried out. 22，727 simple repeat （SSR） sites were detected from 67，369 Unigenes，and functional annotations were performed on Unigenes containing SSR sequences. The results show that，the microsatellite sequences in the transcriptome of the red claw crayfish are abundant，and the dinucleotide and trinucleotide repeat types appear more frequently，accounting for 52.67% and 44.25% of the total SSR frequency，respectively; the tetranucleotide pentanucleotide and hexanucleotide repeat types appeared less frequently，accounting for 2.62%、 0.23%?and 0.24% of the total SSR frequency，respectively. There are 68 SSR repeat types，and the number of repetitions ranges from 5 to 84.5 pairs of SSR primers were screened，and 60 samples from Zhejiang and Taiwan were analyzed for genetic diversity，the average polymorphic fragment per every prime was 5.6. The results of this study lay the foundation for the in-depth development of functional SSR markers of red?claw crayfish，and also support the molecular marker-assisted breeding of red claw crayfish.

Key words： Cherax quadricarinatus; transcriptome; SSR; information of loci

紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目長(zhǎng)尾亞目擬螯蝦科米殼蝦屬，于1992年由湖北省水產(chǎn)科學(xué)研究所引入中國(guó)，因其具有生長(zhǎng)快、食性廣、個(gè)體大、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美、富含低膽固醇和高蛋白質(zhì)、出肉率高、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[1]，逐漸在廣東、湖北、福建、江蘇、湖南、北京、浙江等地推廣養(yǎng)殖。目前，紅螯螯蝦的研究仍較少，主要集中在養(yǎng)殖[2]、育苗[3-5]、病害防治[6，7]、營(yíng)養(yǎng)[8]等方面。紅螯螯蝦分子標(biāo)記及遺傳多樣性研究較少，謝雁南[9]采用磁珠富集法構(gòu)建了紅螯螯蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的富集文庫(kù)，篩選出48個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)，并用于3個(gè)群體的遺傳多樣性分析。

SSR具有共顯性、多態(tài)性相對(duì)豐富、基因組覆蓋高等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)具有易于操作、周期短、等位基因多樣性高和穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定與分析、親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜等研究領(lǐng)域[10]。傳統(tǒng)SSR標(biāo)記的開發(fā)方法工作量大、時(shí)間長(zhǎng)、花費(fèi)高昂且NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的紅螯螯蝦SSR序列數(shù)量有限，可供開發(fā)的SSR引物數(shù)量不多。隨著RNA-Seq技術(shù)的發(fā)展，目前采用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)大量SSR標(biāo)記的技術(shù)被廣泛應(yīng)用在不同物種的遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源分析等方面[10-13]。

本研究在紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用MISA軟件檢測(cè)紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSR位點(diǎn)并分析其分布、組成特征，同時(shí)篩選出具有多態(tài)性的引物用于浙江本地養(yǎng)殖群體與臺(tái)灣引進(jìn)群體的遺傳多樣性檢測(cè)和驗(yàn)證，以期為紅螯螯蝦的遺傳多樣性分析、良種選育和遺傳圖譜構(gòu)建等研究提供序列數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

紅螯螯蝦樣品取自浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合試驗(yàn)基地保種的浙江群體和引進(jìn)的臺(tái)灣群體。取3個(gè)不同個(gè)體的肝臟、精巢和卵巢組織，提取RNA并等量混合用于文庫(kù)構(gòu)建。

1.2?轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得

紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源于本課題紅螯螯蝦高通量測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序。測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行，測(cè)序平臺(tái)采用Illumina HiSeq 2500。測(cè)序完成后，采用Trinity進(jìn)行序列組裝，共獲得含67 369個(gè)SSR位點(diǎn)的Unigenes（總Unigenes長(zhǎng)度為68 775 320 bp）。

1.3?SSR位點(diǎn)搜索和引物設(shè)計(jì)

采用MISA（Micro Satellite identification tool，http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）對(duì)Unigene進(jìn)行SSR位點(diǎn)檢測(cè)，搜索參數(shù)設(shè)置為單核苷酸重復(fù)次數(shù)至少為10次，二核苷酸重復(fù)次數(shù)至少為6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)次數(shù)至少為5次。2個(gè)SSR位點(diǎn)堿基間隔不大于100 bp。

利用Primer3軟件（http：//primer3.sourceforge.net/releases.php）為含有SSR位點(diǎn)的Unigene批量設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)的參數(shù)：序列長(zhǎng)度18～27 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100～350 bp，GC含量40%～60%，退火溫度設(shè)置在55～65 ℃，上下游引物的退火溫度值相差不大于5 ℃;引物長(zhǎng)度在18～25 bp;GC含量在40%～65%;盡量避免出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)、二聚體、錯(cuò)配和引物二聚體等二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.4?SSR-PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括：2×Mix Buffer 10 μL，DNA模板（15 ng/μL）1 μL，去離子水8 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-rad My Cycler Thermal Cycler儀器上進(jìn)行，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min。95 ℃變性30 s，45～60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s;15個(gè)循環(huán)。95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s;20個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳分離鑒定。

1.5?數(shù)據(jù)分析

采用Q-Analyzer軟件對(duì)毛細(xì)管電泳儀獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，將各峰值的位置與其泳道中的分子質(zhì)量?jī)?nèi)標(biāo)進(jìn)行比較得出擴(kuò)增產(chǎn)物大小。

2?結(jié)果與分析

2.1?轉(zhuǎn)錄組中SSR的分布及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

通過(guò)對(duì)紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組的67 369條Unigene （序列總長(zhǎng)約68 775.32 kb）序列進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)這些Unigene序列中含有22 727個(gè)SSR位點(diǎn)，其中4 211條Unigene含有2個(gè)或2個(gè)以上EST-SSR位點(diǎn)?？傮w上，SSR發(fā)生頻率為33.74%，平均每3.03 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR。紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組SSR的類型較為豐富，二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸重復(fù)類型均存在。其中二核苷酸和三核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率較多，分別占總SSR出現(xiàn)頻率的52.67%和44.25%;四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)頻率較少，分別占總SSR出現(xiàn)頻率的2.62%、0.23%和0.24%（表1）。

2.2?轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)類型和頻率特征

從紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組SSR核苷酸基序類型來(lái)看，其中11 054個(gè)SSR位點(diǎn)包含68種重復(fù)基元，二核苷酸至六核苷酸重復(fù)基元分別有4、10、26、11、17種;從分布頻率來(lái)看，出現(xiàn)最多的重復(fù)基元是AC/GT（3 324個(gè)，占30.07%）和AAT/ATT（1 371個(gè)，占10.56%）。二核苷酸重復(fù)基元以AC/GT、AG/CT和AT/AT為主，占其總數(shù)的99.67%。三核苷酸重復(fù)基元以AAT/ATT、AGC/CTG和ACC/GGT最多，分別占其總數(shù)的28.03%、23.86%和12.41%。四核苷酸重復(fù)基元以ACAT/ATGT、AAAT/ATTT和ACAG/CTGT最多，分別占其總數(shù)的28.62%、15.86%和15.86%;五核苷酸重復(fù)基元以AACCT/AGGTT和AAGAT/ATCTT出現(xiàn)頻率最高，分別占其總數(shù)的20%和12%;六核苷酸重復(fù)基元以ACCTGG/AGGTCC和ACGCCC/CGTGGG出現(xiàn)頻率最高，分別占其總數(shù)的15.38%和11.54%（表2）。

2.3?轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)次數(shù)

紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在5～84次，其中5～10次重復(fù)的SSR位點(diǎn)有1 911個(gè)，占總數(shù)的17.29%;11次重復(fù)以上的有80個(gè)，占7.24%。所有紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)單元中，以5次重復(fù)次數(shù)的SSR最多，占7.32%;6次重復(fù)的次之，占3.22%。6種重復(fù)基序的重復(fù)次數(shù)隨著基序堿基數(shù)的增加而減少（表3）。

2.4?SSR引物篩選及驗(yàn)證

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，有5對(duì)SSR引物（CQ-4、CQ-9、CQ-13、CQ-19、CQ-20）對(duì)2個(gè)不同來(lái)源的紅螯螯蝦群體肌肉組織中擴(kuò)增出了具有多態(tài)性的特異性條帶（表4），說(shuō)明這些SSR位點(diǎn)可以作為紅螯螯蝦特有的分子標(biāo)記，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)SSR分子標(biāo)記具有良好的前景。

2.5?SSR多態(tài)性分析

為含SSR位點(diǎn)的100條Unigene序列設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)了100對(duì)SSR位點(diǎn)特異性引物，并驗(yàn)證引物的有效性，隨機(jī)挑選并合成了20對(duì)SSR引物，以浙江本地養(yǎng)殖群體和臺(tái)灣引進(jìn)群體的基因組DNA為模板，對(duì)合成的20對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、篩選。結(jié)果表明，5對(duì)引物擴(kuò)增具有多態(tài)性，占有效引物的25%。5對(duì)引物共得到28個(gè)條帶，每對(duì)引物平均產(chǎn)生5.6個(gè)多態(tài)性片段。引物CQ-4的毛細(xì)管電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

3?小結(jié)與討論

3.1?SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率與其他物種的比較

根據(jù)紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的Unigene進(jìn)行SSR熱分布及其序列特征分析，從67 369條Unigene上發(fā)現(xiàn)22 727個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR發(fā)生頻率為33.74%，平均每3.03 kb出現(xiàn)1個(gè)SSR，和蜜蜂幼蟲相近[14]。但在重復(fù)類型和頻率特征方面，紅螯螯蝦和其他物種有較大的差異。EST-SSR 分析發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂幼蟲中 90%以上為單堿基和二堿基SSR 序列[14，15]，窄足真蚋 EST-SSR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)單核苷酸重復(fù)類型出現(xiàn)的比例最高，占總SSR的87.05%[16]，武昌魚（Megalobrama amblycephalaYih）和黃魚（Larimichthyspolyactis Bleeker）轉(zhuǎn)錄組分析表明二堿基重復(fù)占絕大多數(shù)，其次是占較小比例的三堿基[17]，羅氏沼蝦轉(zhuǎn)錄組中各種SSR出現(xiàn)頻率差異較大，各類型出現(xiàn)的頻率不同，主要為單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復(fù)[18]。2種扇貝轉(zhuǎn)錄組中單核苷酸至六核苷酸重復(fù)SSR均有發(fā)現(xiàn)，從6種重復(fù)基序SSR的數(shù)量來(lái)看，2種扇貝轉(zhuǎn)錄組SSR的優(yōu)勢(shì)基序?yàn)閱魏塑账?、二核苷酸和三核苷酸，四至六核苷酸重?fù)SSR的數(shù)量較少[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，在紅螯螯蝦所有的SSR重復(fù)基序中，占主導(dǎo)地位的重復(fù)基序主要是二核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR的52.67%和44.25%，在二核苷酸重復(fù)基序中，以AC/GT和AG/CT重復(fù)類型出現(xiàn)的次數(shù)最多;在三核苷酸重復(fù)基序中，以AAT/ATT重復(fù)類型為主，這與王斌等的研究結(jié)果相同[20]。物種SSR重復(fù)類型多數(shù)以二、三核苷酸為主，可能是由于三核苷酸突變不易引起物種突變，面對(duì)重大突變壓力時(shí)，物種更傾向選擇三核苷酸，且起源越早、壓力選擇累積越多。在動(dòng)植物的轉(zhuǎn)錄組或基因組中，GC/CG是二堿基重復(fù)的SSR中的稀有重復(fù)基元。本研究發(fā)現(xiàn)GC/CG核心基元數(shù)量?jī)H為1個(gè)，與前人研究結(jié)果類似[21]。

在非模式生物的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)上，現(xiàn)階段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的利用率被大大提升，被廣泛應(yīng)用于各物種的研究當(dāng)中。本研究從100對(duì)四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星引物中篩選獲得了16對(duì)具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記，引物多態(tài)率相對(duì)低于其他魚類的研究結(jié)果。造成多態(tài)性較低的原因，一方面是由于選取的四堿基重復(fù)的微衛(wèi)星相對(duì)于二堿基和三堿基重復(fù)的微衛(wèi)星比較保守，且變異率低;另一方面是由于基于轉(zhuǎn)錄所獲得的EST-SSR擴(kuò)增產(chǎn)物可能跨越內(nèi)含子或者PCR引物位于內(nèi)含子和外顯子的結(jié)合處，從而造成擴(kuò)增失敗，導(dǎo)致多態(tài)率較低。此外，篩選多態(tài)性引物所用樣本的種類、數(shù)量、遺傳差異程度以及不同物種的DNA序列的保守性對(duì)于微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性的篩選亦有不同程度的影響[22]。

3.2?轉(zhuǎn)錄組篩選紅螯螯蝦SSR引物可行且有意義

對(duì)于沒(méi)有基因組信息的非模式物種，主要基于表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析SSR標(biāo)記，由于這些標(biāo)記主要位于編碼區(qū)域（這些區(qū)域?yàn)楣δ芑騾^(qū)），因此研究的SSR結(jié)果更加可靠。而與基于EST數(shù)據(jù)的SSR分析相比，轉(zhuǎn)錄組SSR分析可以獲得更多的信息，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[23]。

本研究發(fā)現(xiàn)，紅螯螯蝦轉(zhuǎn)錄組SSR引物出現(xiàn)頻率高且種類豐富，可為紅螯螯蝦的功能基因挖掘、分子標(biāo)記輔助育種、遺傳多樣性分析、比較基因組研究及遺傳圖譜繪制等研究工作提供候選標(biāo)記，也為今后分子標(biāo)記輔助育種及群體遺傳學(xué)研究提供了第一手研究資料。對(duì)于加速紅螯螯蝦功能基因資源的開發(fā)利用、豐富其分子標(biāo)記類型、遺傳資源評(píng)價(jià)、繪制遺傳圖譜、實(shí)現(xiàn)特定性狀的輔助選擇和進(jìn)行比較基因組學(xué)研究都具有重要的意義，并且結(jié)合這些Unigene基因信息和SSR位點(diǎn)能對(duì)紅螯螯蝦的系統(tǒng)進(jìn)化研究提供依據(jù)。

本研究基于紅螯螯蝦的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)潛在的SSR分子標(biāo)記，隨機(jī)選取的5對(duì)特異性SSR引物可在浙江、臺(tái)灣2個(gè)不同來(lái)源的群體樣品中擴(kuò)增出具有多態(tài)性的片段，這些新開發(fā)的SSR分子標(biāo)記有助于紅螯螯蝦的基因圖譜構(gòu)建、基因多樣性分析、基因定位等研究的深入開展，說(shuō)明基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)大規(guī)模開發(fā)SSR分子標(biāo)記具有良好的應(yīng)用前景。

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