γ-干擾素釋放試驗(yàn)聯(lián)合血清HMGB1及Fe測(cè)定對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病患者的診斷效能分析

李玉美　陳胤文　余曉琳　洪建明　林炳耀　曾今誠(chéng)　林東子

【摘要】 目的：探究γ-干擾素釋放試驗(yàn)聯(lián)合血清高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）及Fe測(cè)定對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病患者的診斷效能。方法：選取2018年1-12月于本院就診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者作為活動(dòng)組（n=154），潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染者作為潛伏組（n=158）。比較兩組γ-干擾素、HMGB1及Fe水平。比較血清γ-干擾素釋放試驗(yàn)、HMGB1及Fe單獨(dú)及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性結(jié)核的診斷效能。結(jié)果：活動(dòng)組γ-干擾素水平明顯高于潛伏組（P<0.05）?；顒?dòng)組HMGB1水平高于潛伏組，F(xiàn)e水平低于潛伏組（P<0.05）。γ-干擾素釋放試驗(yàn)的最佳截?cái)嘀禐?.72 IU/mL;血清HMGB1檢測(cè)的最佳截?cái)嘀禐?.48 μg/L;血清Fe檢測(cè)的最佳截?cái)嘀禐?0.3 μmol/L。聯(lián)合診斷的曲線下面積明顯高于各項(xiàng)單獨(dú)檢測(cè)，且聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確度明顯高于各項(xiàng)單獨(dú)檢測(cè)（P<0.05）。結(jié)論：血清γ-干擾素釋放試驗(yàn)聯(lián)合HMGB1及Fe測(cè)定可提高活動(dòng)性結(jié)核的診斷準(zhǔn)確度，同時(shí)保持較好的敏感度，對(duì)活動(dòng)性結(jié)核診斷有重要的臨床價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】 活動(dòng)性結(jié)核病 γ-干擾素釋放試驗(yàn) 高遷移率族蛋白B1 Fe

[Abstract] Objective： To explore the diagnostic value of γ-interferon release test combined with serum high mobility group box 1 （HMGB1） and Fe determination in patients with active tuberculosis. Method： Active pulmonary tuberculosis patients admitted to our hospital from January to December 2018 were selected as the active group （n=154）， and those infected with latent mycobacterium tuberculosis were selected as the latent group （n=158）. The levels of γ-interferon， HMGB1 and Fe between the two groups were compared. The diagnostic value of serum γ-interferon release test， HMGB1 and Fe single and combined detection for active tuberculosis were compared. Result： The level of γ-interferon in the active group was significantly higher than that in the latent group （P<0.05）. The level of HMGB1 in the active group was higher than that in the latent group， the level of Fe was lower than that in the latent group （P<0.05）. The best cut off value of γ-interferon release test was 2.72 IU/ mL. The best cut off value of serum HMGB1 detection was 4.48 μg/L， and the best cutoff value of serum Fe detection was 10.3 μmol/L. The area under the curve of combined diagnosis was significantly higher than that of individual detection， and the accuracy of combined diagnosis was significantly higher than that of individual detection （P<0.05）. Conclusion： Serum γ-interferon release test combined with HMGB1 and Fe determination can improve the diagnostic accuracy of active tuberculosis and maintain good sensitivity at the same time， which has important clinical value for active tuberculosis diagnosis.

[Key words] Active tuberculosis γ-interferon release test HMGB1 Fe

First-authors address： The Sixth Peoples Hospital of Dongguan City， Dongguan 523008， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.17.029

結(jié)核是嚴(yán)重危害人類健康的慢性傳染病，尤其是在發(fā)展中國(guó)家結(jié)核疾病的負(fù)擔(dān)位居世界前列[1]。據(jù)報(bào)道，中國(guó)的結(jié)核分枝桿菌攜帶者的比例為13%～20%[2]。如果不經(jīng)治療，其中約5%的結(jié)核菌攜帶者將發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核病[3]?；顒?dòng)性肺結(jié)核傳播力強(qiáng)，活動(dòng)性大，可在人群中廣泛傳播，雖然當(dāng)前有多種檢測(cè)結(jié)核病的方法，但是靈敏度和特異性還不能滿足臨床的要求[4]。IFN-γ釋放試驗(yàn)是一種新的用于輔助診斷結(jié)核感染的新的免疫學(xué)方法，其靈敏度和特異性均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)方法，使其在臨床上得以廣泛應(yīng)用[5]。然而，IFN-γ釋放試驗(yàn)在區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病和潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染方面效果有限[5]。隨著臨床研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)HMGB1及Fe水平可作為區(qū)分活動(dòng)性、潛伏性結(jié)核病的輔助診斷因子[6-7]。本研究通過(guò)評(píng)價(jià)血清γ-干擾素釋放試驗(yàn)聯(lián)合HMGB1及Fe測(cè)定對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷價(jià)值，探討其臨床可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1-12月于本院就診的活動(dòng)性肺結(jié)核患者作為活動(dòng)組（n=154），潛伏性結(jié)核分枝桿菌感染者作為潛伏組（n=158）。（1）活動(dòng)組納入標(biāo)準(zhǔn)：抗酸染色檢測(cè)、結(jié)核分枝桿菌PCR檢測(cè)或分枝桿菌培養(yǎng)檢測(cè)陽(yáng)性;且有明顯結(jié)核相關(guān)癥狀。（2）活動(dòng)組排除標(biāo)準(zhǔn)：已進(jìn)行2周以上的抗結(jié)核治療的患者;依從性差、復(fù)診或隨訪困難者;處于妊娠期間;合并肺外結(jié)核病的患者（結(jié)核性胸膜炎除外）;抗酸染色（+）但PCR（-），懷疑為非結(jié)核分枝桿菌感染的患者;人類免疫缺陷病毒感染者。（3）潛伏組納入標(biāo)準(zhǔn)：與活動(dòng)性結(jié)核患者密切接觸，結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，但無(wú)咳嗽、咳痰、發(fā)熱、盜汗等臨床表現(xiàn)，同時(shí)無(wú)影像學(xué)證據(jù)支持肺結(jié)核診斷。（4）潛伏組排除標(biāo)準(zhǔn)：依從性差、復(fù)診或隨訪困難者;處于妊娠期間;有不明原因的感染性疾病者，包括懷疑為非結(jié)核分枝桿菌感染的患者及HIV感染者;有自身免疫性疾病者;有結(jié)核病史者;ICU病房患者及腫瘤患者;使用免疫抑制劑者;人類免疫缺陷病毒感染者。所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書(shū)，本研究已經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 抽取兩組外周靜脈血5 mL，肝素管抗凝，分裝為3 mL和2 mL。γ-干擾素釋放試驗(yàn)：取3 mL外周靜脈血在空白對(duì)照管（N），測(cè)試管（T）和陽(yáng)性對(duì)照管（P）各加入1 mL全血樣本（管經(jīng)肝素抗凝處理），在血液采集4 h內(nèi)將各管放入（37±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h，后以3 000～5 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取血漿檢測(cè)各培養(yǎng)管中γ-干擾素的濃度。測(cè)定血清HMGB1及Fe水平：取分裝的外周靜脈血2 mL，采用Allegray 64R Centrifuge 離心機(jī)型號(hào)離心機(jī)（Beckman Coulter）以2 000 r/min轉(zhuǎn)速，溫度5 ℃，離心時(shí)間10 min，獲得血清，液氮條件下保存，備用。采用HMGB1酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定檢測(cè)受試者血清HMGB1水平，試劑盒由上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)。采用亞鐵嗪法測(cè)定血清Fe水平，亞鐵嗪試劑盒由上海江萊生物科技有限公司生產(chǎn)。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較兩組γ-干擾素水平。（2）比較兩組HMGB1及Fe水平。（3）比較兩組γ-干擾素釋放試驗(yàn)、HMGB1及Fe水平單獨(dú)和聯(lián)合檢測(cè)對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷效能。以血清γ-干擾素釋放試驗(yàn)、HMGB1及Fe水平作為檢驗(yàn)變量，有無(wú)活動(dòng)性結(jié)核病為狀態(tài)標(biāo)量，以1-特異度為X軸，以敏感度為Y軸繪制ROC曲線。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用M（P25，P75）表示，比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn);采用Hanley-McNeil方法比較ROC曲線下面積。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 活動(dòng)組男88例，女66例;年齡31～74歲，平均（57.12±10.74）歲。潛伏組男89例，女69例;年齡30～74歲，平均（59.43±11.28）歲。兩組一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 兩組γ-干擾素水平比較 活動(dòng)組γ-干擾素水平為3.54（2.33，5.46）IU/mL明顯高于潛伏組的1.23（0.76，2.77）IU/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=7.750，P=0.000）。

2.3 兩組HMGB1及Fe水平比較 活動(dòng)組HMGB1水平高于潛伏組，F(xiàn)e水平低于潛伏組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.4 兩組γ-干擾素釋放試驗(yàn)、HMGB1及Fe水平單獨(dú)和聯(lián)合診斷的效能比較 γ-干擾素釋放試驗(yàn)的最佳截?cái)嘀禐?.72 IU/mL;血清HMGB1檢測(cè)的最佳截?cái)嘀禐?.48 μg/L;血清Fe檢測(cè)的最佳截?cái)嘀禐?0.3 μmol/L，見(jiàn)圖1。聯(lián)合診斷的曲線下面積明顯高于γ-干擾素釋放試驗(yàn)、HMGB1、Fe單獨(dú)檢測(cè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合診斷的準(zhǔn)確度明顯高于各項(xiàng)單獨(dú)檢測(cè)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=14.788、8.045、22.475，P<0.05）。見(jiàn)表2、3。

3 討論

結(jié)核主要通過(guò)呼吸道傳播，尤其是活動(dòng)性結(jié)核傳播能力強(qiáng)，成為世界公共衛(wèi)生環(huán)境的重要問(wèn)題之一，因此對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病需要早期診斷識(shí)別[8]。目前臨床上針對(duì)活動(dòng)性結(jié)核病的診斷方法，如γ-干擾素釋放試驗(yàn)、斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)等，在識(shí)別潛伏性結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核方面效果有限，需要探索更為有效的臨床聯(lián)合診斷方法[9-10]。HMGB1及Fe水平是近年來(lái)研究較多的潛伏性結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核診斷輔助因子，通過(guò)不同的血清因子水平判斷患者的結(jié)核活動(dòng)狀態(tài)，具有簡(jiǎn)便安全有效的特點(diǎn)[11]。本研究通過(guò)評(píng)價(jià)血清γ-干擾素釋放試驗(yàn)、HMGB1及Fe水平測(cè)定對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核的診斷價(jià)值，探討其臨床可行性。

血清γ-干擾素釋放試驗(yàn)是通過(guò)抗原刺激致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素水平來(lái)確定結(jié)核分枝桿菌的感染，機(jī)體在結(jié)核抗原刺激下產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，生成可產(chǎn)生干擾素的淋巴細(xì)胞，但是這種刺激在活動(dòng)性及潛伏性結(jié)核中均可發(fā)生，因此在鑒別活動(dòng)性及潛伏性結(jié)核方面價(jià)值有限[12-13]。在本研究中，γ-干擾素釋放試驗(yàn)診斷的敏感度為78.6%，特異度為52.5%，ROC曲線下面積為0.768[（95%CI（0.708，0.829）]。陳誠(chéng)等[14]探究了γ-干擾素釋放試驗(yàn)對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核病的診斷價(jià)值，敏感度和特異度分別為84%、78%，高于本試驗(yàn);但兩者樣本人群的疾病組成不同，可能是存在差異的原因。臨床對(duì)于活動(dòng)性結(jié)核的診斷重點(diǎn)應(yīng)在于提高特異度，本研究中γ-干擾素釋放試驗(yàn)在鑒別潛伏性和活動(dòng)性結(jié)核方面價(jià)值有限，主要是特異度較低，單一診斷依據(jù)可能造成誤診，使一部分患者接受了結(jié)核治療對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害。因此，γ-干擾素釋放試驗(yàn)作為單一的診斷依據(jù)價(jià)值有限，需要和其他方法相結(jié)合提高診斷效能。

HMGB1是存在于細(xì)胞核內(nèi)的一種非組蛋白，參與DNA復(fù)制表達(dá)等重要生命過(guò)程，在細(xì)胞受損傷時(shí)進(jìn)入血清引發(fā)一系列炎癥過(guò)程，在結(jié)核患者中病原菌感染細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥殺傷等免疫反應(yīng)，損傷細(xì)胞內(nèi)的HMGB1進(jìn)入外周血，因此可作為一種結(jié)核病的輔助判斷因子[15]。周安等[16]探究了結(jié)核患者病情與HMGB1水平的關(guān)系，指出HMGB1水平作為結(jié)核患者病情的輔助診斷因子。Fe元素有利于感染巨噬細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)，活動(dòng)性結(jié)核患者對(duì)于Fe元素的需求增大，血清的Fe元素水平常常低于正常狀態(tài)，可通過(guò)測(cè)定血清Fe水平反映患者結(jié)核病情[7]。李劍鵬等[7]認(rèn)為Fe水平與活動(dòng)性結(jié)核病情呈負(fù)相關(guān)。在本研究中，血清HMGB1診斷的敏感度為77.9%，特異度為60.8%;血清Fe水平診斷的敏感度為62.9%，特異度為60.8%，兩種方法獨(dú)立診斷效能有限。

既往表明聯(lián)合多種方法診斷活動(dòng)性結(jié)核病可提高其診斷的準(zhǔn)確度[17-18]。在研究中，三種方法聯(lián)合診斷活動(dòng)性結(jié)核的準(zhǔn)確度明顯高于各項(xiàng)單側(cè)檢驗(yàn)（P<0.05），同時(shí)又較好的敏感度，聯(lián)合診斷曲線下面積顯著高于其他單獨(dú)檢測(cè)（P<0.05），具有較好的臨床應(yīng)用前景。聯(lián)合診斷通過(guò)血清學(xué)的測(cè)定獲得了較為客觀的患者數(shù)據(jù)，避免了因?yàn)閷?duì)于患者癥狀、體征及其他檢查的主觀判斷差異產(chǎn)生診斷的不準(zhǔn)確。聯(lián)合診斷提高了活動(dòng)性結(jié)核診斷的特異度，同時(shí)保持了較好的敏感度，在潛伏性、活動(dòng)性結(jié)核的鑒別診斷方面具有重要意義。

綜上所述，血清γ-干擾素釋放試驗(yàn)聯(lián)合HMGB1及Fe測(cè)定可提高活動(dòng)性結(jié)核的診斷準(zhǔn)確度，同時(shí)保持較好的敏感度，對(duì)活動(dòng)性結(jié)核診斷有重要的臨床價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] Visser H，Passey M，Walke E，et al.Screening for latent tuberculosis infection by an Aboriginal Community Controlled Health Service，New South Wales，Australia，2015[J].Western Pac Surveill Response J，2019，10（4）：24-30.

[2]馬愛(ài)靜，趙雁林.耐藥結(jié)核病的流行和監(jiān)測(cè)現(xiàn)狀[J].中國(guó)抗生素雜志，2018，43（5）：502-506.

[3] Al A S，Kasaeva T，Migliori G B，et al.Tools to implement the WHO End TB Strategy：Addressing common challenges in high and low endemic countries[J].Int J Infect Dis，2020，3（1）：163-171.

[4] Mwaba P，Chakaya J M，Petersen E，et al.Advancing New diagnostic tests for Latent TB infection due multi-drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis-end of the road？[J].Int J Infect Dis，2020，5（5）：625-632.

[5] Xin H，Cao X，Zhang H，et al.Dynamic changes of interferon-gamma Release Assay results along with latent tuberculosis infection treatment[J].Clin Microbiol Infect，2020，3（11）：525-532.

[6]袁樂(lè)永，柯尊瓊.HMGB1基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的關(guān)系[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2019，35（14）：125-133.

[7]李劍鵬，周德玫，甘楚林，等.血清Fe和血小板檢測(cè)對(duì)結(jié)核病活動(dòng)性判斷的臨床價(jià)值[J].海南醫(yī)學(xué)，2016，27（1）：71-73.

[8] Haas M K，Belknap R W.Diagnostic Tests for Latent Tuberculosis Infection[J].Clin Chest Med，2019，40（4）：829-837.

[9] Liu Q，Ma A，Wei L，et al.Chinas tuberculosis epidemic stems from historical expansion of four strains of Mycobacterium tuberculosis[J].Nat Ecol Evol，2018，2（12）：1982-1992.

[10]孫虎，張瑩，劉暉.結(jié)核感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核診斷中的價(jià)值[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2017，15（1）：44-46.

[11] Lui G，Wong C K，Ip M，et al.HMGB1/RAGE Signaling and Pro-Inflammatory Cytokine Responses in Non-HIV Adults with Active Pulmonary Tuberculosis[J].PLoS One，2016，11（7）：e0159132.

[12] Kim J Y，Kang Y A，Park J H，et al.An IFN-gamma and TNF-alpha dual release fluorospot assay for diagnosing active tuberculosis[J].Clin Microbiol Infect，2019，18（5）：239-253.

[13] Lombardi G，Petrucci R，Corsini I，et al.Quantitative Analysis of Gamma Interferon Release Assay Response in Children with Latent and Active Tuberculosis[J].J Clin Microbiol，2018，56（2）：145-153.

[14]陳誠(chéng)，楊健，高海燕，等.γ-干擾素釋放試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)與定量界值的探索[J].國(guó)際呼吸雜志，2018，38（17）：1299-1305.

[15] Chen Y，Zhang J，Wang X，et al.HMGB1 level in cerebrospinal fluid as a complimentary biomarker for the diagnosis of tuberculous meningitis[J].Springerplus，2016，5（1）：1775-1782.

[16]周安，徐巧玲，李明強(qiáng)，等.結(jié)核患者血清TNF-α、IL-1、IL-10和HMGB-1動(dòng)態(tài)變化及臨床意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（2）：285-288.

[17]魏虎，陳振華，范明，等.活動(dòng)性肺結(jié)核患者抗脂阿拉伯甘露糖抗體、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)、干擾素γ水平及其診斷價(jià)值[J].臨床軍醫(yī)雜志，2019，47（12）：1385-1386，1389.

[18]李強(qiáng)，饒常紅，黃渤.γ-干擾素釋放試驗(yàn)、熒光定量PCR、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)聯(lián)合檢測(cè)對(duì)涂陰性肺結(jié)核的診斷價(jià)值[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2017，14（33）：4-8.

（收稿日期：2020-04-14） （本文編輯：田婧）