益水生新飲顆粒HPLC指紋圖譜研究

霍 偉，黃貴慶，梁學政，鄭厚平，潘文桉

(1.柳州市中醫(yī)醫(yī)院 藥學部，廣西 柳州 545000；2.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 藥學部，廣西 南寧 530001)

益水生新飲顆粒是柳州市中醫(yī)醫(yī)院擬研究使用的中藥制劑，該方由山茱萸、龜板、熟地黃、丹參、山藥、杜仲等六味中藥組合成方，六味中藥合用滋補腎陰，平肝潛陽，祛瘀生新，舒筋活絡，標本兼顧，調理陰陽，對于腎陰虧虛、虛熱消渴、頭暈耳鳴、腰膝酸軟等癥具有明顯的療效[1]。醫(yī)院中藥制劑是由中醫(yī)醫(yī)院或綜合性醫(yī)院為滿足臨床使用需求，嚴格按照國家相關政策法規(guī)，根據臨床應用良好的經方、名方、驗方研制而成，僅供本醫(yī)院內部或限定單位調配使用的藥品[2]。其來自于臨床，服務于臨床，經過臨床上反復使用與實踐，大多具備使用簡便、療效準確、價格便宜等特點，是中醫(yī)臨床用藥的重要組成部分[3]。長期以來，柳州市中醫(yī)醫(yī)院為彌補市場藥品不足、確保臨床醫(yī)療需求，持續(xù)研制新的醫(yī)院制劑，益水生新飲顆粒即為其中之一。

中藥指紋圖譜是目前被國內外業(yè)界研究領域普遍接受的一種質量評價方法，可以為研究者提供豐富多樣化的鑒別信息，體現(xiàn)中草藥繁雜化學體系的總體特性，對研究中藥質量分析及控制具有十分重要的意義。在構建中藥現(xiàn)代質量標準體系框架中，中藥指紋圖譜可作為關鍵核心技術之一[4-5]。因此，為了更好地控制制劑質量，獲得穩(wěn)定療效，本研究采用HPLC研究并建立益水生新飲顆粒的指紋圖譜，以期為其質量控制與評價提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 實驗用對照品和中藥材

對照品均采購自中國食品藥品檢定研究院(均可供含量測定用)：馬錢苷(批號：200503)，熊果酸(批號：200517)，齊墩果酸(批號：200504)，毛蕊花糖苷(批號：201007)，梓醇(批號：201009)，丹參酮ⅡA(批號：201009)，丹酚酸B(批號：201009)，綠原酸(批號：200212)。

中藥材均采購于南寧生源中藥飲片有限責任公司，均符合2010年版《中國藥典》飲片藥材的要求：熟地黃(批號：120901，產地為山西)，山茱萸(批號：120901，產地為陜西)，杜仲(批號：120901，產地為四川)，醋龜甲(批號：120901，產地為湖北)，山藥(批號：120901，產地為廣西)，丹參(批號：120901，產地為甘肅)。

1.2 實驗主要儀器及試劑

電子天平(型號：BP211D，德國賽多利斯)；高效液相色譜儀(型號：Agilent1260，分析軟件為Agilent色譜工作站數(shù)據處理系統(tǒng)，美國Agilent公司)；雙頻數(shù)控超聲波清洗器(型號：KQ-200VDB，昆山市超聲儀器有限公司)，Millipore純水儀(型號：simplicity 185，美國密理博公司)；水為純凈水；乙腈、甲醇、冰醋酸、磷酸均為色譜純；乙醇為食用級乙醇，其他試劑如乙酸乙酯、正丁醇等為分析純。

2 方法與結果

2.1 樣品制備及處理

2.1.1 全方制劑 按《中國藥典》2010年版一部附錄ⅠC顆粒劑項下的要求：自制10批益水生新飲顆粒(S1-S10)，批號分別為：120214、130218、121124、130221、121101、121207、121204、121205、130220、130226，備用。

2.1.2 陰性制劑 根據要求制備益水生新飲顆粒方中各味藥的陰性制劑，備用。

2.1.3 供試品溶液[6]取益水生新飲顆粒適量，研細，取細粉10 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，使用移液管精密加入50%乙醇溶液50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，放置冷卻，補足減輕的重量。過濾，取續(xù)濾液10 mL，用30 mL水飽和正丁醇振搖提取2次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇適量溶解，用甲醇定容至5 mL，作為供試品溶液。

2.1.4 對照品溶液 取馬錢苷對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成每毫升含馬錢苷0.112 mg的溶液，濾過，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Inertsil Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.2%冰醋酸梯度洗脫(見表1)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：236 nm，柱溫：25 ℃；檢測器：DAD檢測器。

表1 指紋圖譜檢測流動相梯度洗脫

2.3 指紋圖譜參照峰

所建立的指紋圖譜中，6號峰(后經對照品對比可知為馬錢苷)分離度較好，出峰時間適中，峰面積較大且穩(wěn)定，因此選其為參照峰。在后續(xù)內容中，均以該峰作為參照(標記為S)，用以計算其他峰的相對峰面積和相對保留時間。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取干燥至恒重的同一批(批號：121124)益水生新飲顆粒適量，研細，精密稱取5 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，記錄液相圖譜。各特征峰相對保留時間RSD為0.13%，相對峰面積RSD均小于0.20%，說明該儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取干燥至恒重的同一批(批號：121124)益水生新飲顆粒適量，研細，精密稱取5 g，共6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別進樣，記錄液相色譜圖。各特征峰相對保留時間RSD為0.04%，相對峰面積RSD為0.13%，表明該方法具有較好的重復性。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取干燥至恒重的同一批(批號：121124)益水生新飲顆粒適量，研細，精密稱取5 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液。分別測定其在0 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h的色譜，記錄液相色譜圖。各特征峰相對保留時間RSD為0.45%，相對峰面積RSD為0.87%，說明此樣品在24 h內穩(wěn)定。

2.5 指紋圖譜的建立

于Agilent液相色譜工作站中將10批益水生新飲顆粒的色譜圖以*.AIA格式文件導出，再將導出文件全部導入國家藥典委員會2004年頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》進行共有峰數(shù)據匹配，確定14個共有峰。其中已確認已知成分為6號峰(馬錢苷)及11號峰(丹酚酸B)，由于馬錢苷為臣藥山茱萸的有效成分，其分離度較好，出峰時間適中，峰面積較大且穩(wěn)定，而丹酚酸B為方中佐藥丹參的有效成分之一，相比較，其分離度不如馬錢苷峰好，且為佐藥成分，故選擇馬錢苷作為參照峰，標記為S。結果見圖1、圖2、圖3。

圖1 馬錢苷的HPLC色譜

圖2 益水生新飲顆粒HPLC相對色譜

圖3 益水生新飲顆粒HPLC色譜匹配

2.5.1 指紋圖譜共有峰標定結果 采用國家藥典委員會2004頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》軟件自動匹配10批次益水生新飲顆粒HPLC圖譜，標定其中匹配數(shù)量為10批次的14個色譜峰為共有指紋峰，采用中位數(shù)法作為對照指紋圖譜的生成方法，設定時間寬度為0.15 min，益水生新飲顆粒HPLC共有模式建立對照指紋圖譜見圖3。

由表2、表3可知，峰面積占總面積5%以上的共有峰為1、3、6、10、11、14號。以馬錢苷峰(6號峰)的保留時間和峰面積作為1，分別計算共有指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示，益水生新飲顆粒的相對保時間RDS小于2.0%，相對峰面積RSD小于9.0%。

由此可知，本實驗建立的色譜方法可以使益水生新飲顆粒具有基本一致的色譜行為。

表2 共有峰中單峰面積百分比≥5%相對峰面積

表3 10批益水生新飲顆粒共有峰相對保留時間

表4 10批益水生新飲顆粒共有峰相對峰面積

2.5.2 共有峰與非共有峰面積的計算結果 依據目前中藥注射劑指紋圖譜研究技術要求的有關規(guī)定，供試品的圖譜與指紋圖譜比較，非共有峰總面積不得大于總峰面積的10%，由表4、表5可知，益水生新飲顆粒的非共有峰總面積百分比皆少于10%。

2.5.3 相似度分析 使用國家藥典委員會頒布的2004版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版》軟件進行指紋圖譜相似度計算，以中位數(shù)為相關系數(shù)，設定時間寬度為0.15 min，通過系統(tǒng)自動匹配，得到了10批益水生新飲顆粒HPLC指紋圖譜間的相似度，結果表明10批益水生新飲顆粒指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度值均大于0.9，與對照指紋圖譜有良好的相似性。結果見表6。

表5 共有峰與非共有峰面積的百分比

表6 益水生新飲顆粒HPLC指紋圖譜相似度計算結果

3 討論

3.1 供試品溶液的制備研究

本實驗初期，經查閱文獻復方制劑供試品的制備[7-10]，應優(yōu)選合適的溶劑進行提取，并采用合適的提取方法，最大限度將有效成分及其他活性成分提取出來，這樣制備的供試品，在指紋圖譜中更容易獲得較多的特征峰。本研究采用單因素考察法比較了40%甲醇、70%甲醇、50%乙醇直接提取及50%乙醇提取之后用水飽和正丁醇萃取的情況，結果表明，經水飽和正丁醇萃取之后供試品所得的液相色譜圖分離度較好。

3.2 流動相的優(yōu)化選擇

本研究通過對多種流動相進行對比、等度洗脫與梯度洗脫法進行比較、梯度洗脫條件的改進，尋找適合益水生新飲顆粒指紋圖譜分析的色譜條件[11-12]。實驗結果表明，甲醇-水或酸系統(tǒng)基線不穩(wěn)定，信息較少，而乙腈-水或0.1%酸系統(tǒng)分離度不好，乙腈-0.2%冰醋酸所得圖譜分離度較好，所提供的信息量稍多。因此，最終采用的流動相為乙腈-0.2%冰醋酸。中藥復方制劑成分比較復雜，等度洗脫程序分離效果差，梯度洗脫能夠使成分得到很好的分離[13-14]。

3.3 峰歸屬

實驗中分別做了缺山茱萸、缺熟地黃、缺丹參及缺山藥的陰性實驗，從所得圖譜中大致做了峰歸屬。其中缺山茱萸的色譜圖與樣品的色譜圖比較得出：缺山茱萸的色譜圖中會缺少1、2、6、14號峰及5號與6號峰之間的峰，缺熟地黃的色譜圖會缺少1、2、14號峰，缺丹參的色譜圖會缺少5、8、9、11、12、14號峰，缺山藥的色譜圖會缺少7、13、14號峰；由此可見，樣品色譜圖中屬于山茱萸的特征峰只有6號峰，屬于山藥的特征峰有7、13號峰，屬于丹參的特征峰有5、8、9、11、12號峰。

4 結語

本文對益水生新飲顆粒指紋圖譜分析做了初步研究，僅選用了自制的十批顆粒樣品，益水生新飲顆粒的廣泛性與統(tǒng)一性尚顯不足，應收集更多不同批次的顆粒樣品，獲取更多信息，確保指紋圖譜具有更好的特征性和代表性。關于峰歸屬的實驗，本文只是做了粗略研究，還需要加以完善。