響應(yīng)面法優(yōu)化南瓜籽中抗氧化物提取工藝

朱碧芬，閆加桐，程春生，覃宇悅

（昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明 650550）

南瓜（Cucurbita moschata Duch.），別名番瓜、飯瓜等，是葫蘆科一年生草本植物。南瓜籽就是成熟南瓜的種子，其產(chǎn)量在逐年上升，中國(guó)人食用南瓜籽的歷史悠久。南瓜籽中富含南瓜多糖、活性蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸酸、維生素和礦物質(zhì)等[1-3]。

生物體的生命活動(dòng)會(huì)產(chǎn)生自由基，它們?cè)谏矬w代謝、免疫、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程中都起著重要的作用[4]，但是過(guò)量自由基可攻擊機(jī)體的細(xì)胞和組織，機(jī)體的衰老和許多慢性疾病都與自由基的氧化有關(guān)[5]。近年來(lái)，天然成分的抗氧化性倍受人們關(guān)注[6]，南瓜籽提取物因其抗氧化作用而具有研究?jī)r(jià)值。研究表明南瓜籽中的蛋白和多糖對(duì)DPPH自由基、羥自由基、超氧自由基有較好的清除效果[4，7]。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)南瓜籽蛋白具有降糖活性從而可緩解糖尿病癥[8]。

本研究以單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)脫脂南瓜籽乙醇回流提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定并研究所得提取物的抗氧化能力，為進(jìn)一步開發(fā)南瓜籽中的抗氧化物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

南瓜籽購(gòu)于當(dāng)?shù)馗晒袌?chǎng)，60 ℃烘干，碾壓破碎，過(guò)40目篩，塑封袋裝好備用。福林酚試劑1 mol/L，1，1-二苯基-2三硝基苯肼（DPPH），純度＞97%；三氯化鐵，磷酸氫二鈉，無(wú)水乙醇，鐵氰化鉀，磷酸二氫鈉，無(wú)水碳酸鈉，三氯乙酸，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TU 1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；LXJ-IIB型離心機(jī)，上海安亭科技儀器廠；RE-52CS-2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市科析儀器有限公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 南瓜籽提取物制備

南瓜籽脫脂干燥后，稱取一定量南瓜籽粉末，抗氧化物的提取用回流法。3 500 r/min，離心10 min，靜置，取上清液，蒸干溶劑，乙醇溶解定容至50 mL，得到抗氧化提取物[9]。4 ℃保存，備用。

2.2 提取率測(cè)定

采用恒重法原理測(cè)定。將提取物1 g置于50 ℃干燥箱的蒸發(fā)皿中，加熱1 h，冷卻0.5 h，稱重，反復(fù)干燥至質(zhì)量差不超過(guò)2 mg[10]。提取率計(jì)算公式為:式中，m2為恒重后蒸發(fā)皿和提取物質(zhì)量，m1為蒸發(fā)皿重量，v為提取物總體積，m為南瓜籽干重。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 考察乙醇濃度對(duì)南瓜籽提取率的影響

液料比20∶1 mL/g，提取時(shí)間120 min，提取溫度80 ℃，不同乙醇濃度為（50%、60%、70%、80%、90%）[11]。

2.3.2 考察液料比對(duì)南瓜籽提取率的影響

乙醇濃度70%，提取時(shí)間120 min，提取溫度80 ℃，不同液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 mL/g[12]。

2.3.3 考察提取時(shí)間對(duì)南瓜籽提取率的影響

提取溫度80 ℃，乙醇濃度70%，液料比20∶1 mL/g，不同提取時(shí)間為60、90、120、150、180 min[13]。

2.3.4 考察提取溫度對(duì)南瓜籽提取率的影響

乙醇濃度70%，液料比20∶1 mL/g，提取時(shí)間120 min，不同提取溫度為60、70、80、90、100 ℃[14]。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)，最佳條件為：提取時(shí)間120 min，液料比20∶1 mL/g，乙醇70%，提取溫度80 ℃。設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。使用軟件Design-Expert 8.0.6處理數(shù)據(jù)，根據(jù)響應(yīng)面三維模型確定南瓜籽提取的最優(yōu)條件[15-17]。

2.5 提取物抗氧化活性測(cè)定

2.5.1 清除DPPH自由基能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考相關(guān)文獻(xiàn)[18]，抑制率計(jì)算公式為

式中，Ai是DPPH溶液2 mL加樣品0.4 mL時(shí)的吸光度值，Aj是甲醇溶液2 mL加樣品0.4 mL時(shí)的吸光度值，A0是甲醇溶液2 mL加超純水0.4 mL時(shí)的吸光度值[19]。

2.5.2 還原能力測(cè)定

還原能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19-21]。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 乙醇濃度對(duì)南瓜籽提取率的影響

提取條件為液料比20∶1 mL/g，提取時(shí)間120 min，提取溫度80 ℃，乙醇濃度對(duì)南瓜籽提取率的影響如圖1。南瓜籽提取率隨乙醇濃度的增加先增大，隨后略有下降，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，提取率最高為15.63%。說(shuō)明70%乙醇水溶液的極性與南瓜籽抗氧化提取物的極性最相似，從而使溶質(zhì)的提取率最高，因此乙醇的最佳濃度為70%。

圖1 乙醇濃度對(duì)南瓜籽提取率的影響Figure 1 Effect of ethanol concentration on extraction rate of pumpkin seeds

3.1.2 液料比對(duì)南瓜籽提取率的影響

提取條件為乙醇70%，提取時(shí)間120 min，提取溫度80 ℃，液料比對(duì)南瓜籽提取率的影響如圖2。南瓜籽提取率隨液料比的增加先增高后下降，當(dāng)液料比為20∶1 mL/g時(shí)，提取率最高為15.36%。

液料比是影響傳質(zhì)的主要因素，隨著液料比的增大，傳質(zhì)速率增大，南瓜籽中抗氧化物的提取率也不斷增大，當(dāng)液料比大于20∶1 mL/g時(shí)，提取率略有下降，且還會(huì)增加溶劑處理回收的時(shí)間，增加提取成本，故液料比最佳為20∶1 mL/g。

圖2 液料比對(duì)南瓜籽提取率的影響Figure 2 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of pumpkin seeds

3.1.3 提取時(shí)間對(duì)南瓜籽提取率的影響

提取條件為乙醇70%，液料比20∶1 mL/g，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間對(duì)南瓜籽提取率的影響如圖3。南瓜籽提取率隨提取時(shí)間的增加先增大后下降，當(dāng)提取時(shí)間為120 min時(shí)，提取率最高為14.87%。隨著提取時(shí)間的增大，南瓜籽中抗氧化物溶出的越多，但是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致溶劑揮發(fā)，提取率會(huì)略有下降，因此提取時(shí)間120 min最佳。

圖3 提取時(shí)間對(duì)南瓜籽提取率的影響Figure 3 Influence of extraction time on extraction rate of pumpkin seeds

3.1.4 提取溫度對(duì)南瓜籽提取率的影響

提取條件為乙醇70%，液料比20∶1 mL/g，提取時(shí)間120 min，提取溫度對(duì)南瓜籽提取率的影響如圖4。南瓜籽提取率隨提取溫度的增加先增高后下降，當(dāng)提取溫度為80 ℃時(shí)，提取率最高為14.35%。這主要是因?yàn)闇囟葲Q定溶質(zhì)的熱運(yùn)動(dòng)能力，隨著溫度的升高，溶質(zhì)的提取率增大，但溫度過(guò)高，溶質(zhì)的穩(wěn)定性變差，溶質(zhì)分解導(dǎo)致提取率降低，因此提取溫度80 ℃最佳。

圖4 提取溫度對(duì)南瓜籽提取率的影響Figure 4 Influence of extraction temperature on extraction rate of pumpkin seeds

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)BBD中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取率為考察指標(biāo)（Y），乙醇濃度（A）、液料比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）四個(gè)因素為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)確定南瓜籽的最佳提取工藝。因素水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2，回歸方程為Y=15.01+0.33*A+0.51*B+0.29*C+0.33*D-0.035*AB+0.012*AC-0.018*AD-0.005*BC+0.035*BD-0.46*A2-0.52*B2-0.36*C2-0.62*D2，方差分析見(jiàn)表3。

方差分析表中，模型P ＜0.0001，差異極顯著，且R2=0.9899與R2adj=0.9933接近，說(shuō)明該模型對(duì)南瓜籽提取率（Y）的擬合度好；失擬項(xiàng)=0.22，差異不顯著，說(shuō)明該模型可信度高。一次項(xiàng)A、B、C、D和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的P均小于0.0001，說(shuō)明它們對(duì)Y的影響極顯著，但各因素之間的相互作用較弱（圖5），一次項(xiàng)中對(duì)南瓜籽提取率的影響為C ＜D ＜A ＜B。

表1 Box-Behnken Design因素水平表Table 1 Box-Behnken Design factor level table

表2 Box-Behnken Design 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Experimental Design and results of Box-Behnken Design

各因素對(duì)南瓜籽提取率影響的等高線圖和響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖5。利用Design-Expert8.0.6軟件中的BBD響應(yīng)面優(yōu)化分析，得到南瓜籽提取物的最佳提取條件為：70%乙醇，液料比20∶1 mL/g，提取時(shí)間120 min，提取溫度80 ℃。在最佳提取條件下，進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn)，南瓜籽的提取率為15.11%，與預(yù)測(cè)值15.008%接近，說(shuō)明該模型可以較好地反應(yīng)南瓜籽提取物的最佳提取條件。

3.3 抗氧化能力評(píng)估

3.3.1 提取物的DPPH自由基清除能力

通過(guò)測(cè)定吸光值的變化來(lái)評(píng)價(jià)南瓜籽提取物對(duì)DPPH自由基的清除效果，從而反映南瓜籽提取物的抗

氧化性強(qiáng)弱[22-24]。表4為南瓜籽不同提取率對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果。隨著提取物率的增加，其清除DPPH的能力呈上升趨勢(shì)，當(dāng)南瓜籽提取率為15.63%時(shí)，對(duì)DPPH自由基的抑制率達(dá)87.28%。

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析表Table 3 Analysis of variance of quadratic model of response surface

圖5 各因素對(duì)南瓜籽提取率影響的響應(yīng)面曲線圖Figure 5 Response surface curves of various factors influencing the extraction rate of pumpkin seeds

表4 南瓜籽不同濃度提取物對(duì)DPPH自由基抑制率Table 4 Scavenging power of extracts from pumpkin seeds at different concentrations on DPPH free radicals

3.3.2 不同提取物還原能力

一般情況下，物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性也越高[25-26]。提取物的還原能力見(jiàn)表5。由表5可知，吸光度值隨著提取物濃度的增加而增大，表明南瓜籽的還原能力與其提取率成正比。

表5 南瓜籽不同濃度提取物的還原能力Table 5 Reduction capacity of extracts from pumpkin seeds at different concentrations

4 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Benhnken Design中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以提取率為考察指標(biāo)，乙醇濃度、液料比、提取時(shí)間、提取溫度四個(gè)因素為自變量，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面法，得到南瓜籽最優(yōu)提取條件為：70%乙醇，液料比20∶1 mL/g，提取時(shí)間120 min，提取溫度80 ℃。為南瓜籽的提取提供參考依據(jù)。通過(guò)DPPH自由基清除能力和還原能力測(cè)定，表明南瓜籽提取物具有一定的抗氧化活性，且抗氧化能力與南瓜籽提取率成正比，為后續(xù)有關(guān)南瓜籽抗氧化提取物的深入研究提供參考。