馬抗天花病毒免疫球蛋白的制備及免疫防護(hù)效果評(píng)價(jià)

閆 莉，李 敏，劉 媛，楊曉嵐，谷宏婧，范鐵炯，張志平，閆 芳*，趙忠鵬*

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,山西 太原 030032；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所感染免疫與防治研究室，北京 100071；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 晉中030800； 4.上海賽倫生物技術(shù)股份有限公司，上海 201418)

天花是一種由天花病毒引起的烈性傳染病。天花病毒不僅繁殖快，還能在空氣中迅速傳播，而且在感染后的15～20 d內(nèi)致死率高達(dá)30%。自 1980 年WHO 宣布全球消滅天花后，疫苗停止使用，目前人類已失去針對(duì)天花的免疫力，天花病毒又可以成為重要的生物武器[1]。最近，美國(guó)、俄羅斯高等級(jí)實(shí)驗(yàn)室發(fā)生的生物安全事故，也時(shí)刻提醒我們必須做好充分的準(zhǔn)備[2-3]。盡管有化學(xué)合成藥物用于天花病人治療，但不是特效藥，且存在久用易引起耐藥、肝損傷等關(guān)鍵問題[4]。面對(duì)猴痘病毒的現(xiàn)實(shí)威脅和天花病毒的可能威脅，美國(guó)最近又批準(zhǔn)了一款非復(fù)制型天花疫苗，但也僅限于緊急情況下使用[5]。除通過疫苗接種進(jìn)行預(yù)防以外，亟待研究一種特效的生物治療藥物，以從不同角度進(jìn)行全面防護(hù)。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞痘苗病毒天壇株，是由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病研究所提供，原是自 1926 年從天花患者的皰痂中分離出來的病毒，經(jīng)連續(xù)傳代減毒而獲得。

雞胚成纖維細(xì)胞，SPF雞胚購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司。方法：取9～11日齡SPF雞胚，無菌條件下取出雞胚，去除內(nèi)臟，用Eargl's液清洗3次，剪碎，加入用DMEM 培養(yǎng)液配制的0.25% 胰酶，37℃消化30 min，室溫下靜置，待組織塊沉淀后，將上層胰蛋白酶液倒出，用吸管吹打3次，將組織塊全部分散，吹打后上層細(xì)胞懸液合并，計(jì)數(shù)，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并加入適量DMEM 培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)24～28 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后使用。

Vero細(xì)胞，由軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所細(xì)胞庫提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康馬匹，3～5歲，10匹，經(jīng)檢疫符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求。

BALB/c小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g，購于斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司。

1.3 主要試劑及儀器細(xì)胞用培養(yǎng)基、血清、胰酶購自Gibco公司； ISA206佐劑購自法國(guó)SEPPIC公司；細(xì)胞用培養(yǎng)瓶、細(xì)胞工廠耗材購自Corning公司；區(qū)帶離心機(jī)購自Beckman公司；ACTA Purifier 900純化儀購自Amersham Biosciences公司；層析填料購自GE公司。

1.4 痘苗病毒天壇株的生產(chǎn)、純化及檢定雞胚成纖維細(xì)胞長(zhǎng)滿后，接種痘苗病毒液，接種量為0.1 MOI，37℃培養(yǎng)96～120 h，在細(xì)胞全病變后24 h 內(nèi)收獲病毒。300 000 Millipore超濾膜包濃縮102倍；蔗糖區(qū)帶30 000 r/min離心6 h,分段收集蛋白峰；利用Sepharose 4FF凝膠層析，收集病毒蛋白峰。透射電鏡觀察天壇痘苗株病毒形態(tài)；接種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行無菌檢定；用半流體和肉湯培養(yǎng)基檢測(cè)支原體；接種小鼠、雞胚和細(xì)胞，進(jìn)行外源因子檢查；進(jìn)行HPLC檢測(cè)純度。

1.5 免疫用抗原制備及原料血漿的生產(chǎn)方案1是將純化滅活病毒抗原與等體積的206佐劑混合，乳化，經(jīng)馬匹頜下、腹股溝淋巴結(jié)至少10點(diǎn)注射免疫，前4次基礎(chǔ)免疫劑量分別為1,2,3,4 mg，每次間隔21 d，末次免疫后14 d，測(cè)定中和抗體效價(jià)。方案2是將純化病毒抗原，經(jīng)PBS調(diào)節(jié)濃度，經(jīng)馬匹頜下、腹股溝淋巴結(jié)至少10點(diǎn)注射免疫，前4次基礎(chǔ)免疫劑量分別為5×107,6×107,7×107,8×107PFU病毒量，每次間隔21 d，末次免疫后14 d，測(cè)定中和抗體效價(jià)。2種方案的血清效價(jià)均不低于1∶3 200 時(shí)，采血，分離血清。

1.8 馬抗天花病毒免疫球蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的預(yù)防效果選用BALB/c小鼠20只，分5組，4只/組。用PBS稀釋配制馬抗天花病毒免疫球蛋白4個(gè)濃度，分別為5.2，2.6，1.3，0.65 g/L，每只小鼠靜脈給藥0.5 mL，6 d后靜脈注射痘苗病毒1×106PFU，觀察小鼠體質(zhì)量變化及結(jié)痂、死亡情況。

1.9 馬抗天花病毒免疫球蛋白在動(dòng)物體內(nèi)治療效果選用 BALB/c小鼠20只，分5組，4只/組。每只小鼠靜脈注射痘苗病毒天壇株1×106PFU，觀察小鼠至身體發(fā)痘；再用PBS稀釋配制馬抗天花病毒免疫球蛋白4個(gè)稀釋度，分別約為5.2,2.6,1.3,0.65 g/L，每只小鼠靜脈注射0.5 mL治療；用等量生理鹽水做對(duì)照治療。繼續(xù)觀察各組小鼠體質(zhì)量、出痘及死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 痘苗病毒天壇株的生產(chǎn)、純化及鑒定透射電鏡觀察純化病毒符合痘苗病毒形態(tài)(圖1左),無菌、無支原體、無外源因子；用HPLC檢測(cè)純化的抗原純度在90%以上(圖1右)。結(jié)果表明，免疫用抗原符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 痘苗病毒天壇株純化抗原的檢測(cè)結(jié)果 左.透射電鏡結(jié)果；右.HPLC檢測(cè)結(jié)果

圖2 馬抗天花病毒免疫球蛋白成品檢定結(jié)果 左.成品SDS-PAGE代表性結(jié)果；右.成品HPLC代表性結(jié)果

表1 MTT測(cè)馬抗天花病毒免疫球蛋白對(duì)痘苗病毒天壇株的中和效果

圖3 馬抗天花病毒免疫球蛋白成品預(yù)防實(shí)驗(yàn)小鼠平均體質(zhì)量變化

圖4 馬抗天花病毒免疫球蛋白成品治療小鼠平均體質(zhì)量變化

3 討論

天花是世界上傳染性、致病性最強(qiáng)的疾病之一。由于天花病毒具有極大的傳染性和殺傷性，而且各國(guó)相繼停止接種牛痘疫苗，人類已失去對(duì)天花病毒的免疫保護(hù)，因此，天花病毒有成為極端勢(shì)力的有力生物武器。目前，世界上還有兩處保存天花病毒的場(chǎng)所，位于亞特蘭大的美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心和俄羅斯國(guó)家病毒學(xué)和生物技術(shù)研究中心，近些年，這些保存中心時(shí)常發(fā)生安全事故，加劇了各國(guó)對(duì)生物安全的擔(dān)憂[6]。

盡管有化學(xué)合成藥物西多福韋用于天花病人治療，但療效有限，且副作用很強(qiáng)，至今還沒有特效藥。鑒于目前的生物安全情況，美國(guó)2019年批準(zhǔn)了一款非復(fù)制型天花疫苗，以備不測(cè)。而我國(guó)大多數(shù)人群沒有對(duì)天花的免疫力，隨著我國(guó)海外利益的增多和對(duì)外交往的不斷擴(kuò)大，天花病毒或類似的猴痘病毒成為最為現(xiàn)實(shí)的生物安全威脅[7]，由此研究天花特效藥成為當(dāng)今迫切而又重大的社會(huì)需求。

鑒于人類歷史與傳染病斗爭(zhēng)的經(jīng)驗(yàn)，最有效而經(jīng)濟(jì)的手段之一是抗血清的被動(dòng)免疫治療，在某些重要傳染病的治療和預(yù)防上至今仍被使用，發(fā)揮無可替代的重要作用。

治療性抗體研發(fā)最核心最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是免疫抗原的選擇和制備。痘苗病毒天壇株是自1926 年從天花患者的皰痂中分離出來的病毒，經(jīng)連續(xù)傳代減毒而獲得。痘苗病毒天壇株的使用，使中國(guó)清除了天花，表明，對(duì)天花病毒有免疫保護(hù)效果；同時(shí)，由于同猴痘病毒的親緣關(guān)系很近，有可能對(duì)猴痘病毒有一定的免疫保護(hù)效果。痘苗病毒天壇株的大規(guī)模培養(yǎng)、純化及檢定技術(shù)非常成熟，我們選擇雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)天花病毒，經(jīng)密度梯度離心和層析純化，制備出合格的抗原，其純度達(dá)80%以上，形態(tài)符合天花病毒特征，達(dá)到了現(xiàn)行《中國(guó)藥典》對(duì)免疫用抗原的要求。

健康馬匹的免疫方案，我們選擇了活病毒免疫或滅活疫苗加佐劑免疫兩套方案，雖然都能達(dá)到最終免疫效果，但考慮到活病毒的生物安全顧慮、成本高等因素，最終選擇滅活疫苗加佐劑方案。

對(duì)天花病毒等烈性病原體防治產(chǎn)品開發(fā)的瓶頸是依賴高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室和無天花病毒、猴痘病毒兩個(gè)病原體。借助痘苗病毒天壇株，我們建立了細(xì)胞感染模型和動(dòng)物感染模型2種方法，突破了該瓶頸。雖然2個(gè)模型，不能完全替代用天花病毒或猴痘病毒建立的模型，但考慮到其保護(hù)采用同樣的免疫保護(hù)機(jī)理，可以作為重要而有益的參考[9]。