芬太尼類藥物色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測方法研究

陳庚超，郭媛媛，魯志超，楊雪嬌

(黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東 東莞 523000)

芬太尼類藥物常見的有芬太尼和去甲芬太尼(芬太尼英文名：Fentanyl，分子式C22H28N2O3，CAS號：437-38-7；去甲芬太尼英文名：N-Phenyl-N-(4-piperidiny)propanamide，分子式C14H20N2O，CAS號：1609-66-1)，為阿片類受體激動劑，屬強效麻醉性鎮(zhèn)痛藥，藥理作用與嗎啡類似[1]。可適用于各種疼痛及外科、婦科等手術(shù)后和手術(shù)過程中的鎮(zhèn)痛；也可用于防止或減輕手術(shù)后出現(xiàn)的譫妄，還可與麻醉藥合用，作為麻醉輔助用藥[2-3]。近年來，芬太尼類物質(zhì)的新型合成毒品在美國、加拿大等國迅速發(fā)展蔓延，由于該類物質(zhì)毒性強、品種多、變異快、緝查難，已成為當(dāng)前國際禁毒領(lǐng)域面臨的一大難題[4-5]。2019年 4月1日，公安部、國家衛(wèi)生健康委員會、國家藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合發(fā)布《關(guān)于將芬太尼類物質(zhì)列入非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄的公告》，公安部、國家衛(wèi)生健康委員會、國家藥品監(jiān)督管理局決定將芬太尼類物質(zhì)列入《非藥用類麻醉藥品和精神藥品管制品種增補目錄》，正式將“芬太尼類物質(zhì)”按類納入毒品管制范疇?，F(xiàn)階段還未出臺快速、準(zhǔn)確，高效的檢測標(biāo)準(zhǔn)[6-7]，所以本文旨在使用超高效液相色譜質(zhì)譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀建立具有高準(zhǔn)確性、及時性的檢測方法，這對于新型芬太尼類毒品檢測管制具有十分重要的意義。

1 實 驗

1.1 儀 器

Waters Quattro Preminer XE+UPLC超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀,Waters公司；MS304電子分析天平，梅特勒-托利多儀器公司；Elmasonic P超聲波清洗器，德國Elma儀器公司；Allegra X-30多功能臺式高速離心機，貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司；Seven Easy pH計，梅特勒-托利多儀器公司；Milli-Q IQ7000超純水儀，默克密理博公司。

1.2 試 劑

芬太尼、去甲芬太尼、同位素內(nèi)標(biāo)氘代芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品，純度大于98%。甲醇(色譜純)；乙腈(色譜純)；甲酸(色譜純)；乙酸(色譜純)；醋酸銨(分析純)；氯化鈉(分析純)；氨水(優(yōu)級純)；實驗用水除特殊說明外均為一級水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱取芬太尼、去甲芬太尼、D5-芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度為1000 mg/mL的單標(biāo)儲備液，吸取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇做溶劑配制成1.00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用甲醇做溶劑將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成濃度為1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 血液、尿液等組織液樣品

準(zhǔn)確稱取該類樣品10.00 g(液體樣品也可準(zhǔn)確移取10 mL)于50 mL離心管中，加入適量內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入20 mL乙腈、約3.5 g氯化鈉，充分搖勻后渦旋震蕩提取30 min(300 r/min)，8000 r/min充分離心5 min后準(zhǔn)備進(jìn)行固相萃取[8]。

取4 mL上述離心上清液過HLB小柱(HLB柱使用前依次用3 mL甲醇、3 mL超純水活化)，待樣液流干后，依次用3 mL水淋洗，棄去淋洗液抽干，然后用6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，最后用1.00 mL甲醇定容，過0.22 μm有機系濾膜后待上機測試[9]。

1.4.2 芬太尼類原藥樣品

準(zhǔn)確稱取0.100 g原藥樣品于100 mL容量品中，用約80 mL甲醇溶解后，30 ℃超聲10 min，降溫至室溫后用甲醇定容。然后在按比例稀釋10000后，加入適量內(nèi)標(biāo)，過0.22 μm有機系濾膜后待上機測試。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件的優(yōu)化

在儀器方法開發(fā)過程中，我們分別使用了0.2 mmol/L的醋酸銨水溶液、0.1%的甲酸水溶液、甲醇、乙腈等作為流動相進(jìn)行不同梯度洗脫程序的測試[10]，進(jìn)過比較各目標(biāo)化合物峰形和峰面積相應(yīng)，最終確定了以0.1%的甲酸水溶液+甲醇作為流動相的洗脫程序作為色譜條件，

色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC BEHC18(2.1×100 mm，1.7 μm)，進(jìn)樣量10 μL，柱溫35 ℃，流動相為0.1%甲酸的超純水溶液+甲醇，梯度洗脫程序見表1，流速0.3 mL/min[11]。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure

1.5.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將標(biāo)準(zhǔn)工作液注入質(zhì)譜儀器，經(jīng)多次優(yōu)化各個部分條件，達(dá)到最佳靈敏度，各條件設(shè)置如下述：

(1)毛細(xì)管電壓：1.20 kV；

(2)錐孔電壓：30 V；

(3)離子源溫度：110 ℃；

(4)錐孔反吹氣流量：60 L/hr；

(5)脫溶劑氣氣體溫度：650 ℃；

(6)脫溶劑氣氣體流量：300 L/hr；

(7)碰撞氣氣體流量：0.10 mL/min。

霧化器、輔助加熱氣、碰撞氣等均為高純液氮或等效氮氣發(fā)生器，儀器使用前應(yīng)調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達(dá)到檢測要求[12]。

質(zhì)譜參數(shù)：正離子電噴霧ESI，多反應(yīng)監(jiān)測MRM模式，離子對信息見表2[13]。

表2 芬太尼類化合物質(zhì)譜參數(shù)信息Table 2 Mass spectrum parameters of fentanyl compounds

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液經(jīng)上機測試，在充分優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件后得到了理想色譜圖，如圖1中所示。

圖1 5.00 ng/mL的芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流色譜圖和MRM模式離子對圖Fig.1 Total ion flow chromatogram and MRM mode ion pair diagram of 5.00 ng/mL fentanyl standard

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果計算和表述

本方法按標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法定量，按式(1)計算樣品中芬太尼、去甲芬太尼殘留量。計算結(jié)果需扣除空白值。

(1)

式中：W——樣品中目標(biāo)化合物殘留量，μg/kg

C——芬太尼、去甲芬太尼在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)標(biāo)法中計算出的目標(biāo)化合物濃度，ng/mL

V1——乙腈提取液總體積，mL

V2——分取提取液體積，也即為過柱子樣品上清液總體積，mL

V3——最后樣品定容體積，mL

M——取樣總質(zhì)量，g

在重復(fù)性條件下測得的兩次平行獨立測試結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

2.2 線性范圍及檢出限

實驗室配置標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為1.00、5.00、10.00、20.00、50.00和100.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按本方法經(jīng)儀器上機測試后，以化合物濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)做線性回歸方程，芬太尼、去甲芬太尼線性相關(guān)系數(shù)均在R2=0.99以上，符合實驗檢測的要求，所以本文所述的線性范圍5.00～100 ng/mL。采用1.00 ng/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，以3倍信噪比(S/N)來計算檢出限[14]，確定本方法芬太尼、去甲芬太尼的檢出限均為0.50 ng/mL，定量限均為1.00 ng/mL。

2.3 精密度及回收率

稱取不含待測組分的某尿液樣品10.00 g共20份，其中2份按照實驗方法進(jìn)行處理作為對照組[15]，另外18份樣品分成3組，分別按三水平六平行的原則添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成10、20和100 μg/kg 的3組不同濃度的樣品進(jìn)行添加回收試驗，實驗結(jié)果平均回收率為85%～110%之間，RSD為RSD≤5(n=6)，回收率和精密度見表3[16]。

表3 回收率和精密度(n=6)Table 3 Recovery and precision (n=6)

3 結(jié) 論

本文采用同位素內(nèi)標(biāo)稀釋結(jié)合SPE固相萃取技術(shù)，超高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢測方法對常見芬太尼類藥物進(jìn)行檢測分析，該方法不僅前處理簡單、提取效率高、操作方便等優(yōu)點外，還具有準(zhǔn)確度高、低檢出限，高靈敏度及精密度等特點，能夠符合實驗室對常見芬太尼類藥物的確證工作要求。