FCM聯(lián)合多重PCR技術(shù)在慢性淋巴細(xì)胞白血病基因異常檢測(cè)中的效果分析

顧嬌靈 蔣偉光

（丹東市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 丹東 118000）

近年來(lái)我國(guó)慢性淋巴細(xì)胞白血病發(fā)病率逐漸提升，對(duì)其的診治研究越來(lái)越受到重視，而如今研究證實(shí)腫瘤發(fā)生與抑癌基因失活關(guān)聯(lián)較大，因此需深入研究，結(jié)合疾病生物學(xué)特征和臨床過(guò)程探索可靠的治療方案[1]。如疾病病程為穩(wěn)定性、惰性發(fā)展過(guò)程則無(wú)需藥物治療，若疾病進(jìn)程較快，則需積極治療[2]。FCM作為造血系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)腫瘤診斷的可靠方法，具有細(xì)胞免疫分型精確優(yōu)勢(shì)，配合多重PCR技術(shù)，可檢測(cè)基因的突變，準(zhǔn)確檢測(cè)癌基因的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)患者的個(gè)性化治療[3]。為此，本次研究對(duì)FCM聯(lián)合多重PCR技術(shù)在慢性淋巴細(xì)胞白血病基因異常檢測(cè)的效果進(jìn)行了探討，詳細(xì)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選擇2016年4月至2018年4月本院收治的慢性淋巴細(xì)胞白血病患者52例作為觀察組，另選擇同時(shí)間段本院接收健康體檢者52例作為對(duì)照組，均知曉本次研究?jī)?nèi)容及目的，且自愿簽署知情同意書(shū)。觀察組均滿足《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，其中男患者31例，女患者21例，年齡在40～78歲，平均年齡為（62.25±3.42）歲，Binet分期：A期33例，B期12例，C期7例；對(duì)照組男患者29例，女患者23例，年齡在37～76歲，平均年齡為（62.05±3.41）歲。兩組性別、年齡等基本資料比較無(wú)明顯差異，P＞0.05。

1.2 檢測(cè)方法：均取外周血標(biāo)本和骨髓標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)：①FCM：胞膜染色取100 μL肝素抗凝骨髓與20 μL單克隆抗體混合，再加入溶紅細(xì)胞素2 mL，溶解紅細(xì)胞10 min，隨后采用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入牛血清白蛋白。胞質(zhì)和胞膜染色在溶解紅細(xì)胞10 min后，加入透膜劑0.5 mL，靜置10 min，采用磷酸鹽緩沖液洗滌1次，加入胞質(zhì)抗體20 μL，避光15 min，離心處理，加入牛血清白蛋白。均于24 h內(nèi)完成檢測(cè)工作，采用FACsort流式細(xì)胞儀檢測(cè)，計(jì)算CD45+、CD19+、CD34+、CD10+等百分?jǐn)?shù)，并觀察CD19+細(xì)胞各亞群細(xì)胞分布情況。敏感度檢測(cè)，選擇1例初治免疫分型為CD45-/CDstrong10/CD34+/CD19+的B-ALL患兒初治骨髓標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照組，比例為1:1000、1:10000，依據(jù)正常骨髓供者的單個(gè)核細(xì)胞混合后急性檢測(cè)。②多重PCR檢測(cè)：采用TRIZOL一步法抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：RNA 2 μg.oligo dT 1 μL（0.5 μg/L）.5×Buffer8 μL，dNTP（40 mmol/L）2 μL，AMV10U（1 μL），RNAsin40 U（1 μL）.DTT（100 mmol/L）1 μL加DEPC水至40 μL，70 ℃，10min；冰上至少10 min；42 ℃，1 h；95 ℃，5 min；冰浴5 min，-80 ℃保存。IgVH片段由3個(gè)框架區(qū)、兩個(gè)抗原互補(bǔ)決定區(qū)組成。PCR反應(yīng)體系：MIX I或MIX Ⅱ45 μL，Tap DNA聚合酶1 U（0.25 μL），cDNA模板5 μL，共50 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：94 ℃，7 min；94 ℃，45 s；60 ℃，45 s；72 ℃，90 s擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min。以相同條件擴(kuò)增試劑盒提供的陽(yáng)性和陰性對(duì)照組。PCR產(chǎn)物分析采用未純化PCR原液直接測(cè)序，并采用IMGT/V-QUEsT數(shù)據(jù)庫(kù)分析，明確有無(wú)基因突變及突變位置。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)（%）表示，采用卡方檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組T細(xì)胞各亞群細(xì)胞表達(dá)水平比較：分析表1可知，觀察組CD45+、CD19+細(xì)胞百分率顯著低于對(duì)照組，而CD34+、CD10+細(xì)胞百分率則顯著高于對(duì)照組，P＜0.05。

2.2 不同特征患者IgVH基因重排陽(yáng)性率分析：分析表2可知，不同性別、不同年齡患者IgVH基因重排陽(yáng)性率比較無(wú)顯著性差異，P＞0.05。

表1 兩組T細(xì)胞各亞群細(xì)胞表達(dá)水平比較（%，±s）

表1 兩組T細(xì)胞各亞群細(xì)胞表達(dá)水平比較（%，±s）

表2 不同特征患者IgVH基因重排陽(yáng)性率分析

3 討論

白血病作為嚴(yán)重危害人類健康及生命安全的血液科惡性腫瘤疾病，對(duì)其的盡早發(fā)現(xiàn)及治療極為重要[5-9]。慢性淋巴細(xì)胞白血病作為因細(xì)胞凋亡受阻而導(dǎo)致的B細(xì)胞惡性克隆增值性疾病，臨床特征為成熟的小淋巴細(xì)胞在外周血、骨髓及其他淋巴組織中異常積聚，導(dǎo)致患者出現(xiàn)貧血、無(wú)痛性淋巴結(jié)腫大或肝脾大等癥狀，且促使其免疫功能低下[10-12]。隨著醫(yī)療技術(shù)發(fā)展，如今診斷慢性淋巴細(xì)胞白血病除了單純外周血細(xì)胞淋巴計(jì)數(shù)和血涂片外，應(yīng)借助免疫表型、骨髓活組織檢查。如今實(shí)時(shí)熒光定量PCR可有效檢測(cè)基因的突變和癌基因的表達(dá)量，可進(jìn)行慢性淋巴細(xì)胞白血病WT1基因，腫瘤ER基因等多種基因的表達(dá)檢測(cè)[13-15]。流式細(xì)胞儀可依據(jù)白血病細(xì)胞所表達(dá)的細(xì)胞種系抗原，結(jié)合單克隆抗體檢測(cè)白血病細(xì)胞表面的免疫標(biāo)識(shí)，分析細(xì)胞的來(lái)源和分型[16-18]。而且其還可進(jìn)行抗原組織檢測(cè)，利用熒光密度進(jìn)行白細(xì)胞細(xì)胞的判斷，為疾病治療及預(yù)防提供可靠的依據(jù)[19]。本次研究結(jié)果顯示觀察組CD45+、CD19+細(xì)胞百分率顯著低于對(duì)照組，而CD34+、CD10+細(xì)胞百分率則顯著高于對(duì)照組，P＜0.05；不同性別、不同年齡和不同分期患者IgVH基因重排陽(yáng)性率比較無(wú)顯著性差異，P＞0.05，表明FCM聯(lián)合多重PCR技術(shù)檢測(cè)具有定量分析作用，且熒光檢測(cè)具有靈敏度高，自動(dòng)化程度高等特征，為細(xì)胞移植成功及白血病惡性腫瘤治療提供可靠依據(jù)。

綜上所述，F(xiàn)CM聯(lián)合多重PCR技術(shù)在慢性淋巴細(xì)胞白血病基因異常檢測(cè)的價(jià)值較高，為治療白血病及療效評(píng)價(jià)提供可靠依據(jù)，值得推廣應(yīng)用。