羅非魚加工副產(chǎn)物速釀魚露發(fā)酵過程中呈味物質(zhì)分析

邊昊，陳柏宇，杜金晶，陳志炎，李銳

1(安徽工商職業(yè)學(xué)院,安徽 合肥，231131) 2(廣東海洋大學(xué) 食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088) 3(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，225127) 4(嶺南師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江，524048)

羅非魚(tilapia)，又名非洲鯽魚、福壽魚等，具有生長快、抗病強(qiáng)、產(chǎn)量高等特點(diǎn)，是我國主要養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一[1]。據(jù)《2019年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》，2018年我國羅非魚產(chǎn)量達(dá)162.45萬t，而加工過程中副產(chǎn)物約38.23萬t[2]。羅非魚加工副產(chǎn)物包括魚頭、魚皮、內(nèi)臟和魚骨等，約占整魚體重48%～57%[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚加工副產(chǎn)物中粗蛋白含量約為14.4%～17.6%，同時含有豐富的礦物質(zhì)以及ω-6、ω-3系列不飽和脂肪酸，具有較高的開發(fā)利用價值[5]。由于缺少有效的加工方法，這些副產(chǎn)物通常被丟棄，僅有小部分加工成飼料，這不僅浪費(fèi)了蛋白資源，還對周圍環(huán)境造成嚴(yán)重污染[6]。如何高值化地利用羅非魚加工副產(chǎn)物中的蛋白，已成為近些年來研究的一個熱點(diǎn)。

魚露，又叫魚醬油，是一種風(fēng)味獨(dú)特的傳統(tǒng)水產(chǎn)調(diào)味料，滋味鮮美、營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛[7]。傳統(tǒng)的魚露以低價值的魚蝦(鯷魚、毛蝦、沙丁魚等)或水產(chǎn)下腳料為原料，經(jīng)過鹽漬、發(fā)酵、熬煉等工序，一般需要1～3年方能制得，過長的發(fā)酵時間限制其規(guī)模化生產(chǎn)[8-9]。針對傳統(tǒng)發(fā)酵法的弊端，魚露速釀工藝逐漸成為魚露生產(chǎn)技術(shù)的研究熱點(diǎn)。李銳等[10]以沙丁魚為原料，采用酶解、加曲和保溫的方法生產(chǎn)魚露，大大縮短了發(fā)酵時間，所得產(chǎn)品滋味醇厚，能達(dá)到商品要求。周敏等[11]以淡水魚加工副產(chǎn)物為原料，采用分段加鹽法和添加醬油酵母的方法制備速釀低鹽魚露，大大縮短了發(fā)酵周期，其產(chǎn)品達(dá)到了國家一級魚露標(biāo)準(zhǔn)。目前國內(nèi)外關(guān)于速釀魚露的研究多集中在工藝優(yōu)化，而關(guān)于發(fā)酵過程中滋味物質(zhì)變化的研究鮮有報道。

魚露產(chǎn)品的風(fēng)味與發(fā)酵過程中滋味成分的變化密切相關(guān)[12]。另有研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)酸、呈味核苷酸、游離氨基酸、無機(jī)離子等滋味物質(zhì)的含量與發(fā)酵過程存在一定的相關(guān)性[10,13]。目前快速發(fā)酵法生產(chǎn)的魚露，總體風(fēng)味上與傳統(tǒng)發(fā)酵魚露尚有一定差距，同時存在產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、生產(chǎn)過程中缺少科學(xué)控制標(biāo)準(zhǔn)等問題。本研究以羅非魚加工副產(chǎn)物為原料，采用加曲、加酶的方法制備速釀魚露，并對發(fā)酵過程中氨基態(tài)氮、可溶性總氮、無機(jī)離子、游離氨基酸、有機(jī)酸和呈味核苷酸的含量進(jìn)行分析，探討發(fā)酵各階段呈味成分的變化規(guī)律，以期為魚露的生產(chǎn)工藝優(yōu)化、產(chǎn)品質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚下腳料，由福建海聯(lián)進(jìn)出口貿(mào)易有限公司提供，包括魚頭、內(nèi)臟(除去膽囊)、魚皮、魚骨和魚尾，平板凍結(jié)后于-10 ℃冷鏈運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，并于-20 ℃冷凍保存；其基本營養(yǎng)成分為：水分含量(76.49±1.37)%，粗蛋白含量(10.55±0.54)%，粗脂肪含量(9.68±0.37)%，灰分含量(5.89±0.17)%。

醬油曲精(米曲霉，滬釀3.042)，山東康源生物科技有限公司；復(fù)合蛋白酶，湖南奧馳生物科技有限公司；PDA 培養(yǎng)基，青島捷世康生物科技有限公司；ADP、HxR、Hx、GMP、AMP、ATP、IMP標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；有機(jī)酸和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司；乙腈、甲醇(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

JMS-110型渦流式膠體磨，河北廊坊匯通機(jī)械廠；L-P1200型粉碎機(jī)，鄭州力威設(shè)備有限公司；835-50型氨基酸自動分析儀，日本Hitachi公司；LDZX-5OKBS 型立式蒸汽滅菌鍋，上海深諳醫(yī)療器械廠；Aglient 6410 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；BSC-250型恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；PHS-3C 型酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；H-2050R型冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 醬油曲制備

參照FENG等[14]的方法，稍作改動。將醬油曲接種于PDA培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2 d，挑選長勢良好的菌落，接入斜面培養(yǎng)基，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待斜面長滿黃綠色孢子，儲存于4 ℃冰箱備用。取50 g麩皮和60 mL蒸餾水加入到250 mL三角培養(yǎng)瓶中，于121℃滅菌20 min，冷卻后接入菌種，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 h，每隔20～24 h輕輕搖晃培養(yǎng)瓶使培養(yǎng)基翻動均勻，待黃綠色顆粒長滿培養(yǎng)基時，種曲成熟。

1.2.2 速釀魚露制備工藝

工藝流程：羅非魚下腳料→解凍清洗→切塊粉碎→加水均質(zhì)→加食鹽→加復(fù)合蛋白酶和醬油曲→恒溫發(fā)酵→過濾→滅菌→成品。

參照李銳等[10]的方法，稍作改動。羅非魚下腳料解凍、清洗，切塊后粉碎為肉糜，按照魚質(zhì)量25%的比例加入蒸餾水，然后使用膠體磨均質(zhì)，然后以混合物料重7%的比例加入食鹽，混合均勻后于10 ℃靜置2 h，加入醬油曲[m(醬油曲)∶m(混合物料)=0.004]和復(fù)合蛋白酶[m(酶)∶m(混合物料)=0.002]，混合均勻后置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱，每隔3 d攪拌1次，直至發(fā)酵完成。發(fā)酵0、1、2、3、4、5、6、7、8周時取樣，取樣前將魚露發(fā)酵液攪拌均勻，用200目紗布過濾，濾液于90 ℃水浴15 min，然后用定性濾紙過濾后用于理化指標(biāo)分析。

1.2.3 其他理化指標(biāo)的測定

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 可溶性總氮和氨基態(tài)氮含量的變化

可溶性總氮和氨基態(tài)氮含量是評價魚露產(chǎn)品質(zhì)量的重要參考標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。如圖1所示，可溶性總氮和氨基態(tài)氮含量在整個發(fā)酵過程中均呈先升高后降低的變化趨勢。發(fā)酵時間為0～3周時，魚露中可溶性總氮的含量迅速上升，于第3周達(dá)到最大值，為1.82 g/100 g，隨后逐漸下降；而氨基態(tài)氮含量在發(fā)酵時間為0～3周時增加速度較快，3～5周增加速率減緩，于第5周達(dá)到最大值,為1.46 g/100 g，隨后逐漸下降。這一結(jié)果與周敏等[11]的試驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖1 魚露發(fā)酵過程中可溶性總氮和氨基態(tài)氮含量的變化

根據(jù)前人的報道，魚露在發(fā)酵初期，蛋白在內(nèi)源酶和微生物的作用下被充分降解，生成氨基酸、肽類等物質(zhì)，可溶性氮和氨基態(tài)氮含量迅速增加[20]。相比可溶性總氮,氨基態(tài)氮含量達(dá)到最大值的時間延遲2周，這可能是由于隨著發(fā)酵的進(jìn)行，蛋白酶活力會逐漸降低，魚肉蛋白降解會逐漸趨于平衡。在發(fā)酵第3周蛋白的降解產(chǎn)物中含有一定量的可溶性多肽、小分子蛋白等，在內(nèi)源酶和微生物的作用下，被繼續(xù)分解為氨基酸，使得氨基態(tài)氮含量持續(xù)增加[21]。發(fā)酵后期，部分氨基酸易與羰基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)而被消耗，同時在一部分腐敗微生物的作用下，部分蛋白氮會轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性鹽基氮和生物胺等物質(zhì)[8]。發(fā)酵結(jié)束，可溶性總氮與氨基態(tài)氮含量分別為1.59和1.24 g/100 g，根據(jù)魚露的商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10324—1999，兩者都超過國家一級魚露的標(biāo)準(zhǔn)。李銳等[10]以遠(yuǎn)東擬沙丁魚為原料，通過傳統(tǒng)發(fā)酵法制備魚露，可溶性總氮與氨基態(tài)氮含量分別為2.98和0.94 g/100 g。據(jù)報道，發(fā)酵液中蛋白的降解程度與發(fā)酵時間呈正相關(guān)[22]。速釀魚露由于發(fā)酵時間不足，可溶性總氮含量要低于傳統(tǒng)魚露，但傳統(tǒng)魚露在發(fā)酵后期，部分氨基酸會被不斷消耗，因此氨基態(tài)氮含量會低于速釀魚露。

2.2 無機(jī)離子含量的變化

表1 魚露發(fā)酵過程中無機(jī)離子含量的變化 單位：mg/100 g

2.3 游離氨基酸含量的變化

游離氨基酸與魚露滋味形成密切相關(guān)[23]。速釀魚露發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化如表2所示，速釀魚露未發(fā)酵時游離氨基酸總量為979.01 mg/100 g，鮮甜味氨基酸含量為186.8 mg/100 g，占總量的19.08%。魚露中鮮甜味氨基酸含量在發(fā)酵第0～5周快速增加，與發(fā)酵時間呈正相關(guān)性，并于發(fā)酵第5周達(dá)到最大值，為4 692.16 mg/100 g，占總量的39.24%；在發(fā)酵第6～8周鮮甜味氨基酸含量逐漸下降，與發(fā)酵時間呈負(fù)相關(guān)，這與氨基態(tài)氮含量的分析結(jié)果相一致。李銳等[10]報道了傳統(tǒng)發(fā)酵魚露中游離氨基酸總量為10 869.51 mg/100 g，其中鮮甜味氨基酸占比為48.2%。據(jù)報道，魚露中氨基酸的代謝過程與發(fā)酵過程中微生物活動密切相關(guān)，氨基酸含量會隨著發(fā)酵時間延長而增加[24]。傳統(tǒng)魚露經(jīng)過長時間發(fā)酵能積累較多的鮮甜味氨基酸，而速釀魚露通過添加醬油曲和蛋白酶的方法雖然能加速蛋白的水解，但同時產(chǎn)生較多的苦味氨基酸，鮮甜味氨基酸比例要低于傳統(tǒng)魚露。速釀魚露在風(fēng)味上稍劣于傳統(tǒng)魚露，其優(yōu)點(diǎn)在于降低了產(chǎn)品鹽度，同時縮短了生產(chǎn)周期，便于工業(yè)化生產(chǎn)。

表2 魚露發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化 單位：mg/100 g

續(xù)表2

在鮮味氨基酸中，天門冬氨酸和谷氨酸的含量在發(fā)酵第0～7周時迅速增加，分別于發(fā)酵第6周和第7周達(dá)到最大值(1 240.51和1 398.84 mg/100 g)，隨后含量稍有下降；而在甜味氨基酸中，甘氨酸和丙氨酸均在發(fā)酵第5周達(dá)到最大值(973.60和1 146.15 mg/100 g)，隨后逐漸下降。速釀魚露在發(fā)酵后期苦味氨基酸含量大幅度增加，特別是賴氨酸和精氨酸，與未發(fā)酵時相比，其含量在發(fā)酵第8周分別增加14.27和17.75倍。精氨酸在較低濃度時呈現(xiàn)清爽的鮮味，與其他鮮甜味氨基酸協(xié)調(diào)能增加產(chǎn)品的醇厚感和風(fēng)味層次，而在高濃度時產(chǎn)生苦味，使產(chǎn)品風(fēng)味變差[24]。ZHAO等[25]報道了魚露中耐鹽微生物的次級代謝產(chǎn)物中存在核苷酸、氨基酸、糖類等極性物質(zhì)，而過長的發(fā)酵時間可能會使苦味氨基酸大量積累，使產(chǎn)品風(fēng)味劣化。游離氨基酸含量的變化主要是由于在發(fā)酵初期魚肉蛋白被不斷水解，使游離氨基酸含量快速增加；隨著發(fā)酵時間的延長，微生物的代謝活動會產(chǎn)生新的氨基酸，同時部分氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺和揮發(fā)性鹽基氮等物質(zhì)，非酶促褐變反應(yīng)也會不斷地消耗氨基酸，這使得氨基酸含量發(fā)生變化[26]。

2.4 有機(jī)酸含量的變化

如表3所示，魚露在未發(fā)酵時有機(jī)酸中含量最高的是乙酸(257.88 mg/100 g)，其次為琥珀酸(212.05 mg/100 g)，含量最低為蘋果酸(35.63 mg/100 g)。速釀魚露中有機(jī)酸總量由未發(fā)酵時的758.01 mg/100 g，于第8周增加到2 326.20 mg/100 g，含量增加了2.07倍，這說明速釀魚露在發(fā)酵過程中有大量有機(jī)酸生成。蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸的含量隨發(fā)酵時間延長均逐步增加，且與發(fā)酵時間呈正相關(guān)性。其中乙酸含量增速最快，由未發(fā)酵時257.88 mg/100 g，增加到第8周的1 150.67 mg/100 g，含量增加了3.46倍。琥珀酸含量從212.05 mg/100 g(發(fā)酵第0周)增加到652.19 mg/100 g(發(fā)酵第8周)，含量增加了2.18倍；而乳酸在發(fā)酵0～4周時，其含量緩慢增加，從第5周開始迅速增加，從未發(fā)酵時198.24 mg/100 g增加到發(fā)酵第8周的384.68 mg/100 g。蘋果酸和檸檬酸含量在發(fā)酵過程中增加幅度較小，與未發(fā)酵時相比，這2者在發(fā)酵第8周含量分別增加74.49%和41.1%。

表3 魚露發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化 單位：mg/100 g

乙酸是一種具有爽快酸味的有機(jī)酸，其閾值僅為12 mg/100 g，對魚露的滋味有重要貢獻(xiàn)[12]。乙酸主要由糖類在厭氧菌的作用下產(chǎn)生，由于魚肉中糖類含量很少，被厭氧菌作用的糖類可能來源于種曲中的麩皮。琥珀酸和乳酸是水產(chǎn)品中對呈味有重要貢獻(xiàn)的2種有機(jī)酸，特別是琥珀酸及其鈉鹽[27-28]。有研究指出，丙酮酸脫水還原可形成琥珀酸，另外部分氨基酸在微生物作用下脫去氨基也可形成琥珀酸。部分乳酸可能來自于魚肉本身，大多數(shù)則來自于發(fā)酵過程[12,21,25]。綜上，5種有機(jī)酸中乙酸和琥珀酸含量增加幅度大，且閾值較低，對滋味有重要貢獻(xiàn)，它們共同賦予速釀魚露酸味、鮮味和發(fā)酵香味。

2.5 呈味核苷酸含量的變化

呈味核苷酸影響魚露產(chǎn)品的口感和風(fēng)味。這些核苷酸化合物中，IMP、GMP、AMP因其閾值低且鮮味突出，是重要的呈鮮物質(zhì)[12,23,27]。HxR和Hx是核苷酸降解的最終產(chǎn)物，具有苦澀味，對整體風(fēng)味有不良影響。速釀魚露發(fā)酵過程中呈味核苷酸含量變化如表4所示。魚露在未發(fā)酵時，HxR含量最高，為57.86 mg/100 g，呈鮮味的5種核苷酸(IMP、GMP、AMP、ATP和ADP)含量為111.65 mg/100 g，占總量的55.02%。在發(fā)酵過程中，AMP和Hx含量大幅度增加，其中AMP含量在發(fā)酵第0～6周快速增加，于第6周達(dá)到最大值，為169.26 mg/100 g(增加了4.05倍)，在后期有所下降，但始終處于較高水平；Hx含量變化與發(fā)酵時間呈正相關(guān)性，于發(fā)酵第8周達(dá)到最大值323.18 mg/100 g(增加了8.67倍)。GMP、IMP和HxR含量有小幅度增加，與未發(fā)酵時相比，在發(fā)酵第8周增加了88.67%、21.02%和65.64%。ATP含量在發(fā)酵第0～6周小幅度增加，自第6周后未檢出；ADP含量與發(fā)酵時間呈負(fù)相關(guān)性，在發(fā)酵第0～4周含量逐漸下降，自第4周后未檢出。

表4 魚露發(fā)酵過程中呈味核苷酸含量的變化 單位：mg/100 g

魚露發(fā)酵過程中呈味核苷酸含量變化是一個較為復(fù)雜的動態(tài)過程，受魚肉內(nèi)源酶和微生物中肌苷核苷酶的共同作用[29]。ATP和ADP的化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，隨著發(fā)酵時間增加，兩者易轉(zhuǎn)化為其他關(guān)聯(lián)化合物，而HxR和Hx作為最終降解產(chǎn)物，含量逐漸增加。有研究表明，魚露中的耐鹽微生物在發(fā)酵后期，會產(chǎn)生氨基酸、核苷酸、甘油和糖類等極性物質(zhì)，用來調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓來獲取水分[30]。隨著發(fā)酵時間增加，速釀魚露中呈鮮味的AMP含量大幅度增加，但HxR和Hx大量積累，使魚露的苦味加重，風(fēng)味劣化。因此速釀魚露在生產(chǎn)過程中需合理控制發(fā)酵時間。

2.6 呈味核苷酸與游離氨基酸的協(xié)同增鮮作用

協(xié)同增鮮作用通過EUC來評價，表示呈味核苷酸與鮮味氨基酸的結(jié)合相當(dāng)于一定濃度的味精所產(chǎn)生的鮮味強(qiáng)度[23]。速釀魚露發(fā)酵過程中EUC變化如圖2所示。在發(fā)酵過程中，EUC值呈先上升后下降的變化趨勢。魚露在未發(fā)酵時鮮味氨基酸和呈味核苷酸含量較低，EUC值僅為2.07 g MSG/100 g；隨著發(fā)酵時間增加，蛋白被充分水解，產(chǎn)生大量的鮮味氨基酸，同時微生物的作用使得呈味核苷酸不斷積累，EUC值迅速增加，于發(fā)酵第6周達(dá)到最大值，為17.59 g MSG/100 g。由于呈味核苷酸和鮮味氨基酸含量在發(fā)酵后期呈下降趨勢，在發(fā)酵6～8周時，EUC值不斷下降至10.54 g MSG/100 g。

圖2 魚露發(fā)酵過程中味精當(dāng)量的變化

3 結(jié)論