不同菘藍(lán)種質(zhì)主要表型性狀對品質(zhì)和產(chǎn)量的影響

王 茜，黃 勇，李 斌，李賀敏，周 艷，高致明，張紅瑞

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450046； 2.河南省農(nóng)業(yè)廳 中藥材生產(chǎn)技術(shù)服務(wù)中心，河南 鄭州 450008)

菘藍(lán) (IsatisindigoticaFort.)為十字花科草本植物，其根入藥即板藍(lán)根，也稱靛青根、大青根等，其葉入藥即為大青葉；板藍(lán)根和大青葉均具有清熱解毒、涼血的功效[1-2]。板藍(lán)根是我國目前較為常用的大宗中藥材之一，主產(chǎn)于河南、山西、江蘇、安徽、河北、四川等地[3]。近年來,隨著人們對板藍(lán)根認(rèn)識的深入，對其需求量逐漸增大，其種植面積不斷擴(kuò)大，急需優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的菘藍(lán)種質(zhì)滿足日益增長的用藥需求[4-6]。目前，對菘藍(lán)的研究主要集中在不同產(chǎn)地菘藍(lán)根部多糖及總氨基酸含量比較[7]、播期對菘藍(lán)根部藥用成分含量及產(chǎn)量的影響[8]、施肥對菘藍(lán)農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的影響[9]、不同菘藍(lán)種質(zhì)比較[10]以及栽培技術(shù)[11]、病蟲害防治[12]等方面。由于菘藍(lán)種質(zhì)資源較為豐富,分布較為廣泛，產(chǎn)地自然栽培環(huán)境、菘藍(lán)種質(zhì)等差異導(dǎo)致板藍(lán)根藥材產(chǎn)量、質(zhì)量極不穩(wěn)定，同時，關(guān)于菘藍(lán)主要表型性狀與產(chǎn)量、品質(zhì)關(guān)系的研究[13-15]較少，且各研究結(jié)論不盡相同。在對根莖類藥材的選擇中，地下部性狀是影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，且不易測量[16]，不同地區(qū)不同菘藍(lán)種質(zhì)的表型性狀及產(chǎn)量、品質(zhì)亦不完全相同，而藥材種植既要考慮經(jīng)濟(jì)效益，又要考慮藥材質(zhì)量，鑒于此，對31個不同來源菘藍(lán)種質(zhì)的主要表型性狀及相關(guān)性進(jìn)行分析，以期找到菘藍(lán)表型性狀與其產(chǎn)量、品質(zhì)間的關(guān)系，為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菘藍(lán)種質(zhì)的選育及板藍(lán)根性狀的間接選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試31個不同來源菘藍(lán)屬種質(zhì)，收集自山西、安徽、江蘇、山東、河南、河北、陜西、甘肅、云南、黑龍江等地(表1)，經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材系高致明教授鑒定均為十字花科植物菘藍(lán)(I.indigoticaFort.)。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：Waters 2489-1525高效液相色譜儀(美國Waters公司)、奧豪斯DV2十萬分之一天平(OHAUS公司)、萬分之一電子天平(OHAUS公司)、KQ-500VDV超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)及容量瓶、漏斗、濾紙等；直尺、游標(biāo)卡尺、百分之一電子天平、SPAD-502。

主要試劑：尿苷(批號：887-200202)、鳥苷(批號：B20905)、腺苷(批號：B21356)和(R,S)-告依春(批號：111753-201304)標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，Dikma 公司)、高純水，其余試劑均為分析純。

表1 供試菘藍(lán)種質(zhì)來源

1.3 試驗設(shè)計

2016年4月，將31個不同來源菘藍(lán)種質(zhì)種子種植在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)，按深約2 cm、行距20～25 cm進(jìn)行條播，小區(qū)2 m×2 m，且小區(qū)四周設(shè)1 m保護(hù)行，各小區(qū)間距為50 cm左右，每份菘藍(lán)種質(zhì)設(shè)3次重復(fù)。按常規(guī)田間管理方法進(jìn)行管理。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 菘藍(lán)農(nóng)藝性狀 2016年10月5日采收，從每個小區(qū)隨機(jī)選取生長一致的10株健康樣株觀測記錄其地上部表型性狀(包括葉面平整度、葉形、葉色、葉質(zhì)、葉綠素含量、單株葉片數(shù)、葉長、葉寬、葉鮮質(zhì)量、葉干質(zhì)量)及地下部表型性狀(包括皮色、肉色、根長、根系直徑、根鮮質(zhì)量、根干質(zhì)量)。數(shù)值型數(shù)據(jù)為10株樣株的平均值。其中，葉長為完全展開健康葉片最長主脈長，葉寬為完全展開健康葉片最寬處的寬度，根長為最長根長，根系直徑為根部最粗處直徑；葉長、葉寬、根長均用直尺測量，根系直徑用游標(biāo)卡尺測量；葉綠素含量用SPAD-502測量；干(鮮)質(zhì)量均用百分之一電子天平稱量。

1.4.2 菘藍(lán)根部尿苷、鳥苷、腺苷、(R,S)-告依春含量 色譜條件：參考徐小飛等[17-18]的試驗方法并稍作修改。色譜柱為Agilent(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為水-甲醇，梯度洗脫：0～1 min，0%～5%甲醇；1～20 min，5%甲醇；20～30 min，5%～12%甲醇；30～45 min，12%甲醇。流速1 mL/min，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。停止時間：45 min，后運行：20 min。

對照品溶液的制備：用萬分之一天平稱取對照品尿苷0.002 1 g、鳥苷0.002 1 g、腺苷0.001 6 g、(R,S)-告依春0.005 4 g于50 mL棕色容量瓶中，精密加水至刻度線處，搖勻，即得。

供試品溶液制備：稱取烘干過篩后的板藍(lán)根(菘藍(lán)根)粉末約1 g，精密稱定后，置于50 mL容量瓶中，精密加水定容至50 mL，搖勻，60 ℃條件下超聲30 min，取出放冷，用水補(bǔ)足減少水分至刻度線處，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得。

同時，對該方法進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性以及加樣回收率的考察驗證。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0和Excel 2010軟件進(jìn)行整理和統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 31個菘藍(lán)種質(zhì)的主要表型性狀分析

通過田間觀察與測定，發(fā)現(xiàn)供試31個菘藍(lán)種質(zhì)具有以下共同特征：葉面較為平整(部分種質(zhì)葉面皺縮)，多呈綠色；葉形分長橢圓形和長圓披針形2種形態(tài)，且質(zhì)地厚薄不一；根部肉質(zhì)多為黃色；其他表型性狀間均存在一定差異，供試菘藍(lán)種質(zhì)的主要地上部和地下部表型性狀測定結(jié)果見表2、表3。

由表2可知，菘藍(lán)大部分為平整綠色葉片，其葉綠素含量平均值為46.0 mg/g，變異系數(shù)為0.06%；葉長和葉寬的平均值分別為28.5、5.3 cm，變異系數(shù)分別為0.10%、0.13%，由此可知，葉長、葉寬及葉綠素含量變異均較小，且離散程度較小。菘藍(lán)主要為長圓披針形薄葉片。供試的31個菘藍(lán)種質(zhì)平均單株葉片數(shù)為16.1，變異系數(shù)為0.18%；葉鮮質(zhì)量和葉干質(zhì)量的平均值分別為36.6 g和6.0 g，變異系數(shù)分別為0.32%、0.30%，說明供試菘藍(lán)種質(zhì)單株葉片數(shù)、葉鮮質(zhì)量和葉干質(zhì)量的變異均較大，有較豐富的遺傳多樣性。

表2 31個菘藍(lán)種質(zhì)地上部表型性狀觀察和測定結(jié)果

續(xù)表2 31個菘藍(lán)種質(zhì)地上部表型性狀觀察和測定結(jié)果

由表3可知，菘藍(lán)根表皮以淡棕黃色為主；肉色以黃色為主，部分偏白。根長和根系直徑的平均值分別為17.4 cm、11.55 mm，變異系數(shù)分別為0.08%、0.18%；不同菘藍(lán)種質(zhì)的根鮮質(zhì)量差異較大，最大值為42.9 g，最小值僅為15.2 g，平均值為22.9 g，變異系數(shù)為0.26%；根干質(zhì)量最大達(dá)13.1 g，最小僅為4.4 g,變異系數(shù)為0.24%。結(jié)果顯示，供試31個菘藍(lán)種質(zhì)的根系直徑、根鮮質(zhì)量以及根干質(zhì)量的遺傳多樣性均較豐富。

表3 31個菘藍(lán)種質(zhì)地下部表型性狀觀察和測定結(jié)果Tab.3 Observation and determination of the phenotypic characters of the underground part of 31 I.indigotica germplasm resources

續(xù)表3 31個菘藍(lán)種質(zhì)地下部表型性狀觀察和測定結(jié)果Tab.3(Continued) Observation and determination of the phenotypic characters of the underground part of 31 I.indigotica germplasm resources

2.2 基于表型性狀的菘藍(lán)種質(zhì)聚類分析

應(yīng)用SPSS 19.0 軟件對31個菘藍(lán)種質(zhì)材料進(jìn)行聚類分析，其親緣關(guān)系見圖1。由圖1可知，在歐式距離10處，31個菘藍(lán)種質(zhì)可分為三大類。Ⅰ類主要包括來自河南、安徽、河北、山西、江西、陜西、山東等地20個不同菘藍(lán)種質(zhì)，即河南禹州12號、河南杞縣11號、“三號”、“二號”、河南焦作9號、河南原陽10號、河南汝州13號、安徽阜陽6號和22號、安徽亳州5號和23號、河北邢臺25號、河北石家莊16號、山西臨汾3號、山西萬榮1號、江西樟樹20號、

圖1 基于31個來源菘藍(lán)種質(zhì)表型性狀的聚類分析

陜西商洛17號、云南彌渡21號、黑龍江大慶24號、山東臨駒8號，主要特征為葉片少而短小且窄、葉綠素含量較低、根部細(xì)長、單株產(chǎn)量較低；Ⅱ類主要甘肅、河南、江蘇、河北等地共10個不同菘藍(lán)種質(zhì)，即甘肅隴西26和19號、甘肅張掖18號、河南靈寶14號、“一號”、“四號”、“六號”、江蘇淮南7號、河北文安15號、安徽阮橋4號，主要特征為葉片較大且寬、根部較粗、單株產(chǎn)量相對較高，其中甘肅隴西和江蘇淮南地區(qū)的菘藍(lán)種質(zhì)葉綠素含量明顯高于其他種質(zhì)；Ⅲ類菘藍(lán)種質(zhì)僅為來自山西芮城的2號菘藍(lán)，主要特征為葉片數(shù)較多、葉片長且寬、葉綠素含量較高、根部細(xì)長、單株產(chǎn)量較低。

2.3 菘藍(lán)種質(zhì)數(shù)量性狀的相關(guān)性分析

對供試31個菘藍(lán)種質(zhì)的10個主要數(shù)量性狀進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表4。表4顯示，葉鮮質(zhì)量與根系直徑呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.459；同時，葉鮮質(zhì)量和根系直徑均與根鮮質(zhì)量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.461、0.795。表明可通過提高大青葉鮮質(zhì)量增加板藍(lán)根粗度，進(jìn)一步提高板藍(lán)根產(chǎn)量。

由表4還可看出，葉長與葉寬呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.662；單株葉片數(shù)、葉長、葉寬均與葉鮮質(zhì)量呈極顯著(P<0.01)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.592、0.739、0.634，說明通過對其葉長、葉寬和單株葉片數(shù)進(jìn)行選擇可有效提高大青葉產(chǎn)量。此外，除葉干質(zhì)量與根系長度呈顯著負(fù)相關(guān)之外，其余各指標(biāo)與根系長度均呈不顯著相關(guān)關(guān)系。

2.4 菘藍(lán)各種質(zhì)根部尿苷、鳥苷、腺苷和(R,S)-告依春含量

測定10月5日采收的31個菘藍(lán)種質(zhì)根部尿苷、鳥苷、(R,S)-告依春及腺苷4種品質(zhì)成分的含量，同時對所用方法進(jìn)行考察、驗證，結(jié)果顯示,試驗所用儀器的精密度、制得樣品的穩(wěn)定性、試驗方法的重復(fù)性均良好；尿苷的平均回收率為100.7%，RSD值為1.9%；鳥苷的平均回收率為99.8%，RSD值為1.5%；腺苷的平均回收率為101.4%，RSD值為1.9%；(R,S)-告依春的平均回收率為102.6%，RSD值為1.7%，表明所用方法測得4種品質(zhì)成分含量的準(zhǔn)確度較高。

表4 31個菘藍(lán)種質(zhì)資源10個數(shù)量性狀的相關(guān)系數(shù)Tab.4 Correlation coefficients of 10 quantitative characters of 31 I.indigotica germplasm resources

由圖2可知，菘藍(lán)14號種質(zhì)根部尿苷、2號種質(zhì)根部鳥苷和腺苷、10號種質(zhì)根部(R,S)-告依春含量均最高，分別為0.231%、0.167%、0.220%、0.215%。菘藍(lán)26號種質(zhì)根部的尿苷、22號種質(zhì)根部的鳥苷、4號種質(zhì)根部的(R,S)-告依春以及14號種質(zhì)根部的腺苷含量均最低，分別為0.145%、0.08%、0.136%、0.098%。

圖2 31個菘藍(lán)種質(zhì)根部尿苷、鳥苷、腺苷、(R,S)-告依春含量比較

基于31個菘藍(lán)種質(zhì)表型性狀聚類分析結(jié)果表明，菘藍(lán)4、14、26號種質(zhì)均屬于Ⅱ類，根部較粗、單株產(chǎn)量相對較高，但26號種質(zhì)的尿苷、14號種質(zhì)的腺苷、4號種質(zhì)的 (R,S)-告依春含量均較低，僅14號種質(zhì)的尿苷含量較高；2號種質(zhì)屬Ⅲ類，其根部雖細(xì)長、單株產(chǎn)量較低，但其鳥苷和腺苷含量均較高，表明菘藍(lán)根部指標(biāo)成分含量與表型性狀無直接關(guān)系。

3 結(jié)論和討論

31個不同菘藍(lán)種質(zhì)的葉綠素含量、單株葉片數(shù)、葉長、葉寬等16個表型性狀表明，供試菘藍(lán)種質(zhì)表型變異較為豐富，同時基于表型性狀聚類分析可將供試菘藍(lán)種質(zhì)分為三大類，表明通過表型性狀差異可有效區(qū)分不同菘藍(lán)種質(zhì)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，葉鮮質(zhì)量、根系直徑與根鮮質(zhì)量，單株葉片數(shù)、葉長、葉寬與葉鮮質(zhì)量均呈極顯著正相關(guān)。對采收期菘藍(lán)根部尿苷、鳥苷、腺苷和(R,S)-告依春含量4個質(zhì)量性狀進(jìn)行測定分析可知，菘藍(lán)根部4個質(zhì)量性狀與表型性狀無直接關(guān)系。

譚勇等[14]對來自陜西、安徽和山西3個不同產(chǎn)地的菘藍(lán)種子進(jìn)行水分脅迫，并測定其幼苗葉片的表型性狀、抗氧化物酶活性和根系活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地菘藍(lán)在水分脅迫下的表型性狀等指標(biāo)差異均較大。王興政等[13]比較分析了32份板藍(lán)根種質(zhì)結(jié)籽期的物候期、主要農(nóng)藝性狀及遺傳多樣性，找到遺傳多樣性與板藍(lán)根種質(zhì)資源搜集、管理和利用的規(guī)律；張麗萍等[19]通過研究不同種源板藍(lán)根種子的形態(tài)特征、植株形態(tài)，可基本明確 “大板藍(lán)根種子”和“二倍體板藍(lán)根種子”的基源植物。前兩人的研究均表明，板藍(lán)根種質(zhì)的基本表型性狀與種質(zhì)間關(guān)系密切，與本研究通過表型性狀鑒別菘藍(lán)種質(zhì)類型的結(jié)果一致。尚曉娜等[20]通過對民樂縣、山丹縣、文縣、西和縣、隴西縣等地菘藍(lán)根部所含核苷類及(R,S)-告依春含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)由于菘藍(lán)種質(zhì)不同導(dǎo)致其產(chǎn)量與質(zhì)量各異，而本研究表明，在河南種植的不同菘藍(lán)種質(zhì)雖尿苷、鳥苷、腺苷、(R,S)-告依春含量存在差異，但與其表型性狀之間無直接聯(lián)系，可能由于本試驗將不同菘藍(lán)種質(zhì)種植在同一自然環(huán)境且采用同樣栽培管理措施所致(前人尚未過多關(guān)注河南地區(qū)菘藍(lán)表型性狀與質(zhì)量間的關(guān)系)，后期可進(jìn)一步深入研究河南不同地區(qū)菘藍(lán)種質(zhì)表型性狀與質(zhì)量的關(guān)系，明確其聯(lián)系。王恩軍等[21]通過研究國內(nèi)菘藍(lán)主栽區(qū)18份菘藍(lán)種質(zhì)資源主要農(nóng)藝性狀的變異特征，發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)型大青葉品種的葉片數(shù)多、葉和根鮮質(zhì)量均較大、側(cè)根數(shù)較多，板藍(lán)根產(chǎn)量主要取決于根長和根鮮質(zhì)量；郭巧生等[22]通過對不同種質(zhì)菘藍(lán)生長特性及單株產(chǎn)量的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)根長、單株葉片數(shù)對單株產(chǎn)量影響較大，且各菘藍(lán)種質(zhì)的葉及根部產(chǎn)量存在一定差異，與本研究結(jié)果較為相似。

綜上所述，供試31個菘藍(lán)種質(zhì)間表型差異較大，根據(jù)表型性狀聚類分析結(jié)果可鑒別板藍(lán)根種質(zhì)間的親緣關(guān)系；同時通過對單株葉片數(shù)、葉片大小、根長、根系直徑等性狀的選擇可針對性地提高大青葉或板藍(lán)根產(chǎn)量。