自體外周血單核細(xì)胞移植治療重度下肢缺血早期預(yù)后的影響因素分析

陳 路 胡何節(jié) 方征東 王曉天 孫小杰 葛新寶 程 燦

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院血管外科，安徽 合肥 230001

外周動脈疾?。╬eripheral arterial disease ，PAD）限制了血流，受影響區(qū)域的血供減少，導(dǎo)致四肢動脈缺 血[1-2]。而PAD 中的嚴(yán)重下肢缺血（critical limb ischemia，CLI）是由多種類型的炎性疾病引起，包括糖尿病、閉塞性動脈硬化（arteriosclerosis obliterans，ASO）和血栓閉塞性脈管炎（thromboangiitis obliterans，TAO），其特征是靜息痛和下肢不愈合的潰瘍[3]。國外研究顯示，持續(xù)反復(fù)發(fā)生缺血性休息疼痛或潰瘍，或足部或腳趾壞疽，并持續(xù)＞ 2 周即可診斷為CLI[1]。目前治療CLI 的主要方法是動脈旁路手術(shù)或腔內(nèi)治療[4]，但40%CLI 患者因為動脈硬化病變的位于遠(yuǎn)端流出道血管或病變過于廣泛而無法接受外科或介入手術(shù)[5]，需要進(jìn)行截肢手術(shù)。而自體外周血單核細(xì)胞（auto-peripheral blood mononuclear cells，auto-PBMNCs）可緩解靜息痛，促進(jìn)潰瘍愈合，挽救肢體的滿意效果[4,6-8]，可為不符合手術(shù)指標(biāo)患者提供治療新思路。然而auto-PBMNCs 移植后CLI 預(yù)后因素的變量國內(nèi)外學(xué)者尚未達(dá)成統(tǒng)一意見，本研究探討影響自體外周血干細(xì)胞移植治療CLI 早期預(yù)后的影響因素，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2004 年03 月 至2019 年06 月安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院收治移植auto-PBMNCs 82 例CLI 患者，66 例TAO，16 例ASO，男性75 例，女性7 例，16～88 歲，平均（45.98±14.52）歲。納入CLI 患者Fontaine 分期為Ⅲ～Ⅳ期；術(shù)前下肢計算機(jī)體層血管成像（CT angiography，CTA）或其他影像學(xué)及實(shí)驗室檢查提示遠(yuǎn)端流出道差而考慮旁路手術(shù)或腔內(nèi)手術(shù)效果不滿意者甚至無法實(shí)施手術(shù)者；既往經(jīng)過嚴(yán)格藥物保守治療而效果較差者；近5 年內(nèi)無惡性腫瘤病史的患者。所有患者根據(jù)auto-PBMNCs 移植后視覺模擬評分（visual analogue scale/score，VAS），以及患者移植后早期的疼痛評分分為疼痛緩解組及疼痛加劇組，對兩組患者以截肢作為評估移植后的最終療效，其中截肢是指截除下肢肢體的任意部分。根據(jù)有無截肢分為預(yù)后良好亞組和預(yù)后不良亞組。

1.2 方法

（1） auto-PBMNCs 的動員和采集

所有患者于術(shù)前3 天均經(jīng)粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor， G-CSF）開始動員，并且在注射后的第3 天清晨空腹及在平臥制動狀態(tài)下，立即采血復(fù)查血常規(guī)，采血前需測量體溫，保證患者體溫在正常體溫波動范圍內(nèi)。待血常規(guī)結(jié)果回歸以后，觀察其中的單個核細(xì)胞計數(shù)，如果單個核細(xì)胞（marrow mononuclear cells，MNC）＞30%時，攜帶患者前往輸血科，使用血細(xì)胞分離儀3000 Plus，開始采集外周血單個核細(xì)胞，制備auto-PBMNCs 懸液。以每個手術(shù)肢體30～50 ml 濃縮成細(xì)胞懸濁液，濃縮完畢后的細(xì)胞懸液當(dāng)中，MNC 為1×109/m1，細(xì)胞總數(shù)約為5×109/ml。

（2） auto-PBMNCs 移植

采集后的auto-PBMNCs 于3 h 內(nèi)移植至患肢。術(shù)前先于患肢缺血部位取40～60 個注射點(diǎn)，各點(diǎn)間距2～3 cm， 深度1.0～0.5 cm，每點(diǎn)注射約0.7～1.0 ml 細(xì)胞懸液。術(shù)后當(dāng)天即予以抗血小板、改善微循環(huán)處理，并根據(jù)每個患者不同情況予以個體化降壓、降糖等處理，針對潰瘍創(chuàng)面予以清創(chuàng)、換藥，并隨訪。通過電話訪問及門診檢查對患者進(jìn)行隨訪，患者術(shù)后隨訪時間6 個月。所有auto-PBMNCs 移植患者在術(shù)后都嚴(yán)格接受了抗血小板（西洛他唑）治療。

1.3 觀察指標(biāo)

統(tǒng)計所有患者入院時Fontaine 分期、吸煙史；移植 前的白細(xì)胞計數(shù)、血紅蛋白計數(shù)、血小板計數(shù)、單核細(xì)胞計數(shù)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶計數(shù)、血肌酐、血尿素氮；入院后首次檢測得到的空腹血糖、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、纖維蛋白酶原；及注射后白細(xì)胞計數(shù)和單核細(xì)胞計數(shù)。

1.4 判定指標(biāo)

各檢查指標(biāo)的正常參考范圍：白細(xì)胞（3.50～9.50）×109/L； 血紅蛋白（130.0～175.0）g/L；單核細(xì)胞（0.10～0.60）×109/L；血小板計數(shù)（125.0～350.0）×109/L；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（9～50）IU/L；血尿素氮（3.10～8.00）mmol/L；空腹血糖（3.9～6.1）mmol/L；PT（8.00～14.00）s；APTT（20.00～40.00）s；纖維蛋白原（1.70～4.00）g/L。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料采用（）表示；計數(shù)資料采用n（%），組間比較采用χ2和Fisher 檢驗；移植后疼痛及預(yù)后不良的多因素分析采用Logistics 逐步回歸分析，當(dāng)P ＜0.05 時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效

術(shù)后3 d 無發(fā)熱即出院，82 例患者術(shù)后1 個月未見明顯并發(fā)癥及不良反應(yīng)。在術(shù)后1～6 個月內(nèi)，通過門診隨訪及電話回訪，未見明顯不良反應(yīng)。

2.2 移植后疼痛及預(yù)后不良的單因素分析

移植前兩組患者丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05，表1）；兩亞組患者纖維蛋白原比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05，表2）；移植后，疼痛加劇發(fā)生率14.63%（12/82）；截肢率為15.85%（13/82）。其中9 例TAO 因疼痛加劇，截肢7 例；2 例ASO 疼痛加劇，截肢 6 例。移植后，兩組及兩亞組患者的白細(xì)胞和單核細(xì)胞計數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表1～2。

2.3 移植后疼痛及預(yù)后不良的多因素分析

將丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和纖維蛋白原賦值后，納入Logistics 逐步回歸分析，移植前丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶＞ 50 IU/L 和纖維蛋白原≥4 g/L 是移植后疼痛加劇及預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素，見表3。

3 討論

PAD 患者中1%～3%會進(jìn)展至CLI[10]，目前針對CLI 的治療手段，血運(yùn)重建是CLI 是治療基礎(chǔ)[10]。自2002 年，Tateishi 等[4]研究證明干細(xì)胞移植治療CLI 有效以來。目前對無法接受手術(shù)的患者，多采取了外周血單個核細(xì)胞移植治療這一簡便、微創(chuàng)的方法。但針對早期患者術(shù)后出現(xiàn)預(yù)后不良的原因，國內(nèi)外鮮有研究報告。本研究結(jié)果顯示，移植前丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶＞50 IU/L 和纖維蛋白原≥4 g/L 是移植后疼痛加劇及預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶主要分布在肝細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生損傷或通透性受損的時候，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶可由肝細(xì)胞內(nèi)釋放入血，有研究表示丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶異常的患者，心血管意外及代謝綜合征的發(fā)生率升高[12-13]。目前多數(shù)代謝綜合征患者的研究中均提示丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶異常為其危險因素，但其具體作用機(jī)制尚未明確。但當(dāng)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶升高時，患者的血脂已在血管內(nèi)發(fā)生了沉淀。一項研究認(rèn)為，冠脈狹窄與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶呈相關(guān)性嚴(yán)重下肢缺血的研究中，天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶與丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶之比（AAR）＞1.67 的患者，預(yù)后較其他AAR 低于此值者明顯較差[14]。上述研究結(jié)果也引起了廣泛關(guān)注，在本研究中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在疼痛分組中比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但本研究結(jié)果僅認(rèn)為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶＞50 IU/L，可以對患者疼痛恢復(fù)產(chǎn)生影響。

纖維蛋白原是一種由肝臟細(xì)胞合成和分泌的糖基化蛋白，大多數(shù)情況下纖維蛋白原被認(rèn)為單純血栓形成因素，而目前越來越多的研究證明纖維蛋白原作為動脈粥樣硬化的獨(dú)立危險因素，纖維蛋白及其降解產(chǎn)物參與了血栓形成和動脈粥樣硬化的發(fā)展過程[16]。其中，降解產(chǎn)物中的二聚體片段沉積于血管壁可使動脈發(fā)生硬化改變。另外，動脈硬化是缺血性事件常見的病理基礎(chǔ)，其主要原因是由于內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致。研究認(rèn)為增高的纖維蛋白原在一定程度上可以影響內(nèi)皮細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)動脈硬化的發(fā)生和發(fā)展[17]。也有研究從TAO 動物模型中發(fā)現(xiàn)，壞疽癥狀時，內(nèi)皮細(xì)胞損傷嚴(yán)重，從而形成血栓[16]。而外周血單核細(xì)胞移植的其核心主要是通過含有內(nèi)皮祖細(xì)胞的單個核細(xì)胞進(jìn)行移植進(jìn)而讓內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)新生血管，最終治療缺血性疾病。這也證實(shí)了本研究結(jié)果。

纖維蛋白原在一定基礎(chǔ)上對動脈管腔的再狹窄有著不可或缺的影響，也論證本研究中高纖維蛋白原為患者預(yù)后不良的危險因素可能。兩預(yù)后亞組患者纖維蛋白原比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，纖維蛋白原＞4 g/L 的患者在auto-PBMNCs 治療后更需要嚴(yán)格的抗血小板和或抗凝治療。綜上所述，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶＞50 IU/L 是患者術(shù)后疼痛加劇的危險因素，纖維蛋白原＞4 g/L 是患者術(shù)后發(fā)生截肢的危險因素。

表1 兩組患者auto-PBMNCs 移植后疼痛加劇的單因素分析

表2 兩亞組患者auto-PBMNCs 移植后預(yù)后不良的單因素分析

表3 移植后疼痛及預(yù)后不良的多因素分析