異牡荊苷作為sortase A抑制劑對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌肺炎的保護(hù)作用

田莉莉，母 丹，王 莉，王鐵東，王大成，高 豐，王 琳*

(1.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130062；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130062)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一種重要的人畜共患和機(jī)會(huì)性病原體，可引起多種疾病，如癥狀輕微的皮膚感染或心內(nèi)膜炎、菌血癥、敗血癥、骨髓炎、血液感染和肺炎等嚴(yán)重感染[1]。由于高毒力及多藥耐藥性金黃色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)的出現(xiàn)和廣泛傳播，導(dǎo)致了很高的致病率和死亡率，嚴(yán)重危害公共健康，引起了極大關(guān)注[2]。金黃色葡萄球菌通過(guò)分泌大量的毒力因子而引發(fā)感染，這些因子包括表面相關(guān)黏附素和分泌的蛋白毒素[3]。表面相關(guān)黏附素能與宿主組織和細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)細(xì)菌黏附到細(xì)胞外基質(zhì)成分或侵入到細(xì)胞內(nèi)[4-5]。分泌的蛋白毒素和酶能破壞宿主細(xì)胞和組織或幫助細(xì)菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的清除，促進(jìn)細(xì)菌在宿主體內(nèi)的傳播[6]。利用小分子抑制劑靶向金黃色葡萄球菌的毒力因子是一種很有前途的抗感染策略，它在不給細(xì)菌施加選擇性壓力的情況下減弱細(xì)菌的毒力，從而降低耐藥性產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)[7-8]。據(jù)報(bào)道，ClfA/ClfB、纖維蛋白結(jié)合蛋白(FnBPs)和膠原黏附素(CAN)等表面相關(guān)黏附素都是導(dǎo)致金黃色葡萄球菌引發(fā)感染的重要蛋白，這些細(xì)胞表面蛋白均通過(guò)sortase A(SrtA)被共價(jià)錨定在細(xì)菌表面[9-11]。

SrtA是一種被廣泛研究的膜定位轉(zhuǎn)肽酶，它通過(guò)介導(dǎo)多種黏附蛋白在細(xì)菌表面的分布在金黃色葡萄球菌的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[12]。研究表明，SrtA基因突變能夠顯著減少細(xì)菌表面蛋白的錨定[13]，并且抑制SrtA能顯著降低金黃色葡萄球菌的毒力，從而改善肺炎、膿毒癥和感染性心內(nèi)膜炎的預(yù)后[14-17]。因此，SrtA成為開發(fā)新型抗感染藥物的理想靶標(biāo)。

目前報(bào)道的SrtA抑制劑主要有植物天然產(chǎn)物、小分子化合物和擬肽化合物等，均對(duì)金黃色葡萄球菌感染具有較好的治療作用[18-19]。異牡荊苷(apigenin-6-C-glucoside)是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于各種食用或藥用植物中，如葫蘆科的果實(shí)或木豆、小麥、三角果和竹子的葉子中[20]。它具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗阿爾茨海默病和抗癌作用[21-24]。課題組先前的研究表明，異牡荊苷在體外對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抗菌作用，但能夠通過(guò)抑制SrtA的活性抑制生物膜的形成和SpA在細(xì)胞壁上的錨定[25]。盡管我們已證實(shí)異牡荊苷是一種有效的SrtA抑制劑，但作用機(jī)制和其對(duì)金黃色葡萄球菌感染的治療效果尚不清楚。在本研究中，我們通過(guò)分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬確證了異牡荊苷與金黃色葡萄球菌SrtA的相互作用模式和結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)一步通過(guò)肺炎模型評(píng)價(jià)了其對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌感染性肺炎的治療作用。本研究的結(jié)果表明，異牡荊苷或可作為開發(fā)治療金黃色葡萄球菌感染藥物的先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑MRSA菌株USA300購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC，Manassas，VA)；USA300ΔSrtA菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存；用于蛋白表達(dá)載體的大腸桿菌BL21(DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存；pET28a-SrtA質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；腦心浸液培養(yǎng)基(brian heart infusion;BHI),LB培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博有限公司；胎牛血清購(gòu)自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；異牡荊苷購(gòu)自四川普菲德生物有限公司；兔抗SrtA多克隆抗血清由本實(shí)驗(yàn)室保存；溶菌酶購(gòu)自北京索萊寶生物公司；異丙基硫-D-半乳糖苷(IPTG)購(gòu)自上海生工生物有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購(gòu)自碧云天生物公司；His標(biāo)簽融合蛋白純化層析柱購(gòu)自GE公司；SrtA底物肽Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2由上海吉爾生化有限公司合成；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 SrtA蛋白的純化采用熱激法將pET28a-SrtA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21(DE3)中，經(jīng)卡那霉素抗性篩選，挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落，鑒定正確后以1∶100接種到 LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至D600為0.6～1.0時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基硫-D-半乳糖苷(IPTG)在16℃培養(yǎng)過(guò)夜，以誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。采用Ni-NTA親和層析技術(shù)對(duì)帶有 His 標(biāo)簽的SrtA蛋白進(jìn)行純化，以10 mmol/L 咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，300 mmol/L咪唑緩沖液洗脫目的蛋白，收集目的蛋白，備用[25-26]。

1.3 SrtA活性測(cè)定通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FRET)考察SrtA活性[27-28]。在300 μL反應(yīng)體系中加入10 μmol/L純化的SrtA蛋白和不同濃度異牡荊苷于黑色96孔平板中，37℃下避光孵育30 min，然后加入終濃度為50 μmol/L的SrtA底物肽Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2，只加入緩沖液和底物肽作為對(duì)照組，室溫下孵育1 h后，測(cè)定在350 nm激發(fā)波長(zhǎng)，496 nm發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度。

1.4 SrtA可逆抑制試驗(yàn)將100 μL純化的SrtA蛋白(10 μmol/L)與200 μmol/L的異牡荊苷(10 × IC50)混合，37℃恒溫孵育1 h后，添加9.9 mL反應(yīng)緩沖液將混合物稀釋至100倍。然后在黑色96孔板中加入190 μL稀釋液及10 μL SrtA底物肽Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2(終濃度為10 μmol/L)，使用酶標(biāo)儀測(cè)定在350 nm激發(fā)波長(zhǎng)、495 nm發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度[29]。

1.5 Western blot分析將金黃色葡萄球菌USA300與不同質(zhì)量濃度異牡荊苷(0，32，64，128，256 mg/L)在BHI培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)至D600為0.8，用PBS洗滌2次后，離心(500 r/min，4℃，1 min)收集菌體，加入10 g/L溶菌酶和40 g/L溶葡球菌酶的裂解緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA和250 mmol/L蔗糖，pH 7.4)在37℃孵育1 h裂解細(xì)菌。采用12% SDS-PAGE凝膠分離等量的細(xì)菌蛋白(20 μg)，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，用TBST洗滌3次，加入兔抗SrtA多克隆抗血清(1∶500)孵育2 h，洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，洗滌后加入ECL底物顯色液觀察條帶。

1.6 細(xì)胞侵襲試驗(yàn)金黃色葡萄球菌侵襲人肺腺癌A549細(xì)胞試驗(yàn)參考之前的文獻(xiàn)報(bào)道[30-31]。將A549細(xì)胞(3×105細(xì)胞/孔)接種于24孔培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)(37℃，5% CO2)，將過(guò)夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌USA300和ΔSrtA按照1∶100比例接種至含終質(zhì)量濃度為64，128，256 mg/L的異牡荊苷的培養(yǎng)基中， 0.5% 二甲基亞砜(DMSO)作為空白對(duì)照組，在37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)至D600為1.0，以不含異牡荊苷的BHI肉湯培養(yǎng)的ΔSrtA菌株為陽(yáng)性對(duì)照。按照1∶100接種金黃色葡萄球菌后，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。每個(gè)孔用PBS沖洗3次，再加入1 mL含有300 mg/L慶大霉素的DMEM /高葡萄糖培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。用新鮮培養(yǎng)基將培養(yǎng)板洗滌3次，用無(wú)菌蒸餾水裂解細(xì)胞，分3份分別涂在BHI瓊脂平板上，計(jì)數(shù)CFU并按照CHEUNG等[32]描述的方法處理數(shù)據(jù)。

1.7 分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬為了研究異牡荊苷與SrtA的結(jié)合機(jī)制，從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載金黃色葡萄球菌SrtA的三維結(jié)構(gòu)(Protein Data Bank[PDB]ID:1T2P)。使用Autodock vina 1.1.2進(jìn)行分子對(duì)接以研究異牡荊苷和SrtA之間的結(jié)合模式[33]。利用Amber14軟件包中的分子動(dòng)力學(xué)模擬程序，對(duì)從分子對(duì)接中獲得的異牡荊苷-SrtA復(fù)合物的最佳對(duì)接姿勢(shì)(構(gòu)象)進(jìn)行了25 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，并計(jì)算結(jié)合自由能[34-37]。

1.8 金黃色葡萄球菌肺炎小鼠模型的建立金黃色葡萄球菌USA300在37℃ 過(guò)夜培養(yǎng)，按1∶100稀釋至200 mL新鮮無(wú)菌BHI培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至D600=1.0。然后離心收集培養(yǎng)液，PBS洗滌菌體3次，重懸于100 μL PBS中。7周齡C57BL/6J小鼠用異氟醚麻醉，滴鼻接種30 μL(2×109CFU)金黃色葡萄球菌懸液[38]。感染1 h后皮下給予100 mg/kg的異牡荊苷，此后每隔12 h給小鼠注射1次異牡荊苷。對(duì)照組小鼠皮下注射相同體積的含0.5% DMSO的無(wú)菌PBS。統(tǒng)計(jì)12,24,36,48,60,72,84,96 h小鼠的死亡情況，計(jì)算生存率。

肺組織細(xì)菌計(jì)數(shù)和組織病理學(xué)分析，將15只C57BL/6J 小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，分別為金黃色葡萄球菌USA300感染組(mock)、異牡荊苷治療組(isovitetin)和突變組(ΔSrtA)。用30 μL(1×109CFU)的金黃色葡萄球菌懸液滴鼻感染小鼠，2 h后給藥，給藥量和給藥方式同生存率實(shí)驗(yàn)相同。感染后24 h頸椎脫臼處死，然后用無(wú)菌技術(shù)取出左肺，一半用于菌落計(jì)數(shù)，另一半置于1%福爾馬林中固定，HE染色后光鏡下觀察肺組織切片，采集圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析研究中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism5.0進(jìn)行分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,以P值<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001。

2 結(jié)果

2.1 異牡荊苷可逆抑制金黃色葡萄球菌SrtA活性采用FRET法研究異牡荊苷對(duì)SrtA活性的抑制作用，結(jié)果如圖1A所示，異牡荊苷以劑量依賴的方式抑制SrtA的活性， IC50值為(28.98±0.21) mg/L。為了進(jìn)一步確定異牡荊苷對(duì)SrtA的抑制是否可逆，將10倍IC50濃度的異牡荊苷與與單獨(dú)的緩沖液(對(duì)照)或SrtA孵育并稀釋，然后通過(guò)SrtA底物肽Abz-LPATG-Dap(Dnp)-NH2裂解測(cè)量SrtA活性，其中對(duì)照樣品的活性為100%。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SrtA的活性恢復(fù)至(83±2.31)%(圖1B)，表明異牡荊苷對(duì)SrtA的抑制是可逆的，通過(guò)非共價(jià)作用結(jié)合于分選酶的活性位點(diǎn)。

圖1 異牡荊苷對(duì)SrtA的抑制作用 A.異牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌USA300 SrtA的體外活性抑制作用；B.異牡荊苷對(duì)SrtA的可逆抑制作用

2.2 異牡荊苷不抑制SrtA的表達(dá)為確定異牡荊苷是否抑制SrtA的表達(dá)，用不同質(zhì)量濃度的異牡荊苷(0，32，64，128，256 mg/L)分別處理金黃色葡萄球菌，提取總蛋白，Western blot分析SrtA的表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示，異牡荊苷處理組的條帶與未處理組的條帶一致，表明異牡荊苷不影響SrtA的表達(dá)。

圖2 SrtA蛋白的Western blot分析

2.3 異牡荊苷抑制金黃色葡萄球菌侵襲A549細(xì)胞金黃色葡萄球菌感染的主要部位通常是上皮細(xì)胞，在細(xì)胞表面定植或通過(guò)SrtA介導(dǎo)的細(xì)胞表面蛋白侵入細(xì)胞，導(dǎo)致急性和慢性感染。我們利用上皮細(xì)胞系A(chǔ)549確定異牡荊苷是否能抑制金黃色葡萄球菌侵襲上皮細(xì)胞。結(jié)果如圖3所示，與PBS處理的對(duì)照組相比，256 mg/L異牡荊苷處理組細(xì)胞內(nèi)金黃色葡萄球菌的數(shù)量顯著減少。這一結(jié)果表明，異牡荊苷通過(guò)抑制SrtA的活性減弱了金黃色葡萄球菌USA300對(duì)A549細(xì)胞的侵襲。

圖3 異牡荊苷減弱金黃色葡萄球菌USA300對(duì)A549細(xì)胞的侵襲 與對(duì)照組相比，*示P<0.05,**示P<0.01,***示P<0.001。下同

2.4 異牡荊苷與SrtA的結(jié)合機(jī)制為了探索異牡荊苷和SrtA之間的潛在結(jié)合模式，使用AutoDock vina 1.1.2和Amber14軟件包進(jìn)行分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬。為了確定對(duì)接模型的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定性和方法的合理性，計(jì)算了基于模擬時(shí)間的起始結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)骨架的均方根偏差(RMSD)值。結(jié)果表明，系統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在模擬過(guò)程中達(dá)到了穩(wěn)定狀態(tài)(圖4A)，氫鍵、靜電和范德華相互作用是異牡荊苷與SrtA相互作用的主要作用力。具體而言，殘基Ala-92靠近異牡荊苷的葡萄糖基，在SrtA和異牡荊苷之間形成氫鍵相互作用(鍵長(zhǎng)：1.9?)(圖4C)。用AmberTools 15中MM-GBSA方法計(jì)算了異牡荊苷結(jié)合位點(diǎn)周圍的殘基對(duì)結(jié)合自由能的總貢獻(xiàn)，在SrtA-異牡荊苷復(fù)合物中，殘基Ala-92有較強(qiáng)的靜電作用力貢獻(xiàn)(ΔEele)，其ΔEele小于-14.6 kJ/mol(圖4B)。此外，殘基Arg-197靠近異牡荊苷的黃酮支架，形成陽(yáng)離子-π相互作用，表現(xiàn)出中等的ΔEele貢獻(xiàn)，ΔEele<-10.5 kJ/mol(圖4B)。此外，Ala-104、Ile-182、Trp-194和Ile-199的側(cè)鏈ΔEele<-4.2 kJ/mol，由于這些殘基與異牡荊苷接近，與異牡荊苷形成強(qiáng)烈的范德華相互作用?？偟膩?lái)說(shuō)，大部分分解能相互作用源于范德華相互作用，主要通過(guò)疏水作用，如Ala-92、Ala-104、Ala-118、Val-166、Ile-182、Val-193、Trp-194和Ile-199。此外，通過(guò)計(jì)算SrtA-異牡荊苷復(fù)合物的總結(jié)合自由能，發(fā)現(xiàn)異牡荊苷的ΔGbind約為-65.7 kJ/mol，表明異牡荊苷能與SrtA強(qiáng)結(jié)合。

圖4 異牡荊苷與SrtA相互作用的分子模擬 A.SrtA-異牡荊苷復(fù)合物的所有原子相對(duì)于其初始結(jié)構(gòu)隨時(shí)間變化的均方根偏差(RMSD)； B．在SrtA-異牡荊苷復(fù)合物中基于每個(gè)殘基分解結(jié)合能； C．SrtA蛋白與異牡荊苷結(jié)合關(guān)鍵氨基酸殘基

2.5 異牡荊苷對(duì)小鼠金黃色葡萄球菌肺炎的保護(hù)作用由于異牡荊苷能抑制SrtA的活性和金黃色葡萄球菌對(duì)A549上皮細(xì)胞的侵襲，為進(jìn)一步確定異牡荊苷否具有體內(nèi)保護(hù)作用，我們建立了小鼠金黃色葡萄球菌肺炎感染模型，以7周齡C57BL/6J小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)滴鼻接種致死劑量的金黃色葡萄球菌USA300，治療組每12 h注射一次異牡荊苷，每隔12 h計(jì)算感染小鼠的死亡率至96 h。結(jié)果如圖5 A所示，異牡荊苷治療組24,48,72 h的死亡率明顯低于對(duì)照組(P值分別為0.005,0.032,0.025)，說(shuō)明異牡荊苷能夠顯著降低小鼠死亡率。

小鼠感染金黃色葡萄球菌24 h后，將采集的肺部組織研磨涂板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。結(jié)果如圖5 B所示，感染金黃色葡萄球菌的小鼠肺部菌落數(shù)為(6.21±0.178) lg CFU/g，經(jīng)異牡荊苷治療后，與對(duì)照組相比肺部菌落數(shù)顯著降低，僅為(4.7±0.169) lg CFU/g，表明異牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌感染引起的小鼠肺炎具有一定的治療效果。

為了評(píng)估異牡荊苷對(duì)小鼠肺炎的保護(hù)作用，首先對(duì)肺組織外觀進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示異牡荊苷治療組小鼠肺組織呈粉紅色和海綿狀，局灶性感染較少，而感染對(duì)照組小鼠肺組織表面呈紅色和斑駁狀，有許多局灶性感染(圖5 C)。病理組織學(xué)分析顯示，模型組小鼠肺泡腔大部分被炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而用異牡荊苷治療組炎癥顯著減輕，如肺泡腔中炎性細(xì)胞積聚較少。綜上所述，異牡荊苷可以減弱金黃色葡萄球菌的體內(nèi)毒力，對(duì)金黃色葡萄球菌引起的小鼠肺炎具有較好的保護(hù)作用。

圖5 異牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的小鼠肺炎的治療作用 A．異牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌USA300肺炎小鼠的保護(hù)率；B．異牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌USA300感染小鼠肺組織載菌量影響；C．異牡荊苷對(duì)金黃色葡萄球菌USA300肺炎小鼠肺組織的保護(hù)作用

3 討論

金黃色葡萄球菌是醫(yī)院和社區(qū)獲得性肺炎的主要致病菌之一，迫切需要開發(fā)新型高效的抗感染藥物來(lái)控制多重耐藥金黃色葡萄球菌引起的感染。

SrtA是金黃色葡萄球菌的一個(gè)重要毒力因子，在表面蛋白錨定到細(xì)胞壁的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用[39]，這些表面蛋白能夠介導(dǎo)細(xì)菌定植到宿主組織和細(xì)胞、形成生物膜和逃避免疫反應(yīng)等。因此，靶向SrtA并阻斷表面蛋白的錨定是治療金黃色葡萄球菌感染的一種有效途徑。SrtA突變株在小鼠肺炎模型中表現(xiàn)出弱毒力，表明SrtA在葡萄球菌肺炎的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用[40]。因此，我們可以通過(guò)干擾SrtA的活性來(lái)抑制表面蛋白的錨定，進(jìn)而治療金黃色葡萄球菌引起的肺部感染。本研究證實(shí)異牡荊苷能顯著降低金黃色葡萄球菌對(duì)A549細(xì)胞的侵襲作用。通過(guò)分子對(duì)接及分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法進(jìn)一步確證了異牡荊苷與SrtA的相互作用位點(diǎn)，闡明了異牡荊苷抑制SrtA的作用機(jī)制。結(jié)果表明，異牡荊苷與SrtA的結(jié)合主要依賴于氫鍵、靜電及范德華力相互作用，相互作用的殘基主要有Ala-92、Ala-104、Ala-118、Val-166、Ile-182、Val-193、Trp-194和Ile-199。此外，異牡荊苷治療顯著提高了MRSA致死劑量感染小鼠的存活率，降低了肺組織中的存活細(xì)菌數(shù)，改善了肺組織的病理?yè)p傷，減輕了肺部炎癥。這些治療作用可能是由于SrtA的抑制導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和侵襲減少，表明異牡荊苷是治療金黃色葡萄球菌肺炎優(yōu)秀的候選化合物。據(jù)報(bào)道，活性殘基Arg197、H120和C184都是SrtA發(fā)揮底物催化作用的關(guān)鍵位點(diǎn)[41]，因此，異牡荊苷可能是通過(guò)阻礙酶與底物結(jié)合發(fā)揮抑制StrA活性的作用。

據(jù)報(bào)道，在醫(yī)院肺炎感染中，MRSA的出現(xiàn)率不斷增加，這使得該病難以治愈[42]。盡管該疾病可以用萬(wàn)古霉素(首選藥物)治療，但死亡率仍然很高，并且出現(xiàn)中度耐藥性[43]。在新生小鼠的肺炎模型中，SpA被證明是起關(guān)鍵作用的毒力因子[44]。此外，ZIMMERLI等[45]的研究證明葡萄球菌嵌入細(xì)胞外基質(zhì)的能力在慢性和持續(xù)性感染(如肺炎，心內(nèi)膜炎和異物相關(guān)感染)中起著重要作用，而金黃色葡萄球菌侵入宿主細(xì)胞之前首先要黏附在細(xì)胞表面，這些與黏附相關(guān)的蛋白以及SpA都是通過(guò)SrtA錨定到細(xì)胞壁發(fā)揮作用的，因此可以推斷SrtA是金黃色葡萄球菌感染引起的肺炎中的重要毒力因子。本研究表明，異牡荊苷治療顯著提高了金黃色葡萄球菌肺炎小鼠的存活率，降低了肺組織中的存活細(xì)菌數(shù)，改善了肺組織的病理?yè)p傷，減輕了肺部炎癥。這些治療作用可能是由于藥物對(duì)SrtA的抑制導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)上皮細(xì)胞的黏附和侵襲減少，進(jìn)一步從體內(nèi)證明異牡荊苷是治療金黃色葡萄球菌肺炎優(yōu)秀的候選化合物。

綜上所述，本研究表明異牡荊苷是SrtA的可逆性抑制劑，在體內(nèi)可以減弱MRSA的毒力，對(duì)金黃色葡萄球菌引起的肺炎具有較好的保護(hù)作用。因此，異牡荊苷是一種潛在的先導(dǎo)化合物，可作為治療MRSA感染的抗毒性藥物進(jìn)一步開發(fā)。