貴州省HPAIV和NDV免疫抗體檢測及其R語言分析

陳國權(quán)，吳征卓，姚碧瓊，施大軍，張 旭，閻朝華，周碧君,3*，王開功,3，程振濤,3，文 明,3*

(1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；3.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；4.三穗縣鴨產(chǎn)業(yè)化建設(shè)管理辦公室，貴州 三穗縣 556500；5.貴州千里山生態(tài)食品股份有限公司，貴州 三穗縣 556500)

禽流感(avian influenza,AI)是由A型流感病毒(avian influenza virus,AIV)引起禽類呼吸道或全身性感染的一種急性傳染病[1-2]。AIV可感染人、家禽、野生鳥類和部分哺乳動物等[3]。根據(jù)AIV對雞的致病性，可將AIV分為高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus,HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus,LPAIV)[4]。世界衛(wèi)生組織(OIE)將HPAI列為法定報告的動物疫病，中國也將其列為一類傳染病[5]。目前發(fā)現(xiàn)僅有部分H5和H7亞型AIV可引起HPAI，且這些亞型的病毒也能感染人，影響公共安全[6]。AIV在全球范圍內(nèi)傳播，擴散到家禽中并引起人類的人畜共患感染，并給人類帶來經(jīng)濟、健康、種族和社會問題[7]。新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的一種禽類急性高度接觸性病毒性傳染病[8]。NDV感染雞最常觀察到神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)的病變[9]。NDV在世界各地流行，時有暴發(fā)，給全球養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，被OIE列為必須報告的一類傳染病[10]。目前沒有有效治療AI和ND的方法，家禽養(yǎng)殖者主要依靠嚴格的生物安全防控和疫苗接種來控制這2種暴發(fā)性疫病的傳播[11]。

我國屬于養(yǎng)禽大國，且大部分都是中小型養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶。不同地區(qū)、不同溫度、不同養(yǎng)殖方式和不同海拔對雞群的免疫效果不同，若免疫失敗會導致疫病的暴發(fā)。有學者已經(jīng)報道了內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省、西安市和延安市等地區(qū)[12-15]不同養(yǎng)殖模式、不同季節(jié)和不同養(yǎng)殖地區(qū)免疫抗體水平的差異性，而貴州省關(guān)于免疫抗體水平差異性的分析還比較欠缺。為了解貴州省各地區(qū)H5,H7亞型AIV和NDV的免疫抗體水平及與養(yǎng)殖方式、溫度和海拔等因素的相關(guān)性。本實驗室通過收集2015—2018年貴州省9個市(州)294個養(yǎng)殖場(戶)送檢的11 017份雞血清樣本，以血凝抑制試驗方法進行H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體水平檢測，并使用易侕統(tǒng)計軟件和R語言對不同地區(qū)、養(yǎng)殖方式、溫度和海拔等因素對H5,H7亞型AIV和NDV的免疫情況的影響進行分析，為貴州省制定更科學的免疫程序和防控H5,H7亞型AIV和NDV提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒樣品源于貴州省2015—2018年9個市(州)的294個養(yǎng)殖場(其中安順市27個、貴陽市39個、銅仁市17個、遵義市31個、畢節(jié)地區(qū)27個、黔南州36個、黔東南州36個、黔西南州45個、六盤水市36個)已免疫H5,H7亞型AIV和NDV疫苗的雞群，通過翅靜脈采血約2 mL，靜置30 min，4℃ 4 000 r/min，5 min并吸取血清置于1.5 mL無菌離心管中，標記血清來源的地區(qū)、養(yǎng)殖場規(guī)模、溫度和海拔等信息。共收集血清樣本11 017份，其中免疫H5,H7亞型AIV和NDV疫苗待檢血清分別為6 534，1 341和3 142份。分別置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑AIV H5亞型(Re-8株)血凝抑制試驗抗原和AIV H7亞型(H7N9株)血凝抑制試驗抗原購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；NDV血凝抑制試驗抗原購自哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司。

1.3 血清抗體檢測HPAIV H5,H7和NDV抗體均采用血凝抑制試驗(HI)方法檢測。HPAIV H5,H7抗體檢測的具體操作參照國家標準《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T 18936-2003)中的HI試驗進行，HI抗體效價≥24，結(jié)果判定為合格；雞新城疫抗體檢測執(zhí)行《雞新城疫診斷技術(shù)標準》(GB/T16550-2008)，HI抗體效價≥25，結(jié)果判定為合格[16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計根據(jù)國家標準中陰陽性判斷標準判定不同地區(qū)、養(yǎng)殖方式、溫度和海拔對H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體水平，采用易侕統(tǒng)計軟件和R語言進行單因素和多因素分析，計數(shù)樣本以份數(shù)表示，采用P值，單因素分析有統(tǒng)計學意義的則納入多因素分析，采用線性回歸模型進行多因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 貴州省各地區(qū)H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫平均情況按照國家農(nóng)業(yè)部動物疫病監(jiān)測的標準，H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率≥70%，判定為群體免疫合格。采用血凝抑制試驗方法對貴州省9個市(州)294個養(yǎng)殖場的H5,H7亞型AIV和NDV進行疫苗免疫抗體監(jiān)測。結(jié)果顯示，貴州省9個市(州)294個養(yǎng)殖場總體H5,H7亞型AIV和NDV的免疫抗體陽性率分別為84.80%(5 541/6 534)，64.95%(871/1341)和90.48%(2 843/3 142)，H5亞型AIV和NDV的免疫抗體陽性率達到國家農(nóng)業(yè)部動物疫病監(jiān)測的標準(圖1)。

圖1 貴州省9個市(州)H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率

2.2 不同地區(qū)對H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況分析針對貴州省不同地區(qū)，采用易侕統(tǒng)計軟件和R語言對294個養(yǎng)殖場的H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫結(jié)果進行差異性分析。結(jié)果顯示，H5,H7亞型AI免疫抗體陽性率在貴州省的不同地區(qū)中差異均極顯著(P<0.01)，而對NDV疫苗免疫效果差異不顯著(圖2)。

2.3 不同養(yǎng)殖方式對H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況分析針對各地區(qū)的不同養(yǎng)殖方式，采用易侕統(tǒng)計軟件和R語言對294個不同養(yǎng)殖方式(其中規(guī)?；B(yǎng)殖場151個，散養(yǎng)戶143個)的H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況進行差異性分析。結(jié)果顯示，不同養(yǎng)殖方式對H5亞型AIV的免疫效果影響差異顯著(P<0.05)，而對H7亞型AIV和NDV的免疫效果影響不顯著(圖4)。表明養(yǎng)殖方式對貴州省各個地區(qū)的H5亞型AI的疫苗免疫陽性率有較大影響，而對貴州省各個市(州)的H7亞型AIV和NDV影響不大，養(yǎng)殖戶可根據(jù)需要選擇。

圖3 不同養(yǎng)殖方式對H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率的影響

2.4 不同溫度對H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況分析針對各地區(qū)的不同溫度，將暴露變量溫度從連續(xù)變量轉(zhuǎn)換為分類變量(根據(jù)溫度不同分為3組：低值組(2～11℃)97個養(yǎng)殖場、中值組(12～18℃)89個養(yǎng)殖場、高值組(19～30℃)108個養(yǎng)殖場)，并比較不同溫度之間的基線變異性。采用易侕統(tǒng)計軟件和R語言對294個養(yǎng)殖場H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況進行差異性分析。不同溫度對H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況差異統(tǒng)計結(jié)果顯示，溫度變化對H5亞型AIV的免疫效果影響差異極顯著(P<0.01)，而對H7亞型AIV和NDV的免疫效果影響不顯著(圖4)。表明溫度對貴州省各個地區(qū)的H5亞型AIV的疫苗免疫陽性率有較大影響。

圖4 不同溫度對H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率的影響

2.5 不同海拔對H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況分析針對各地區(qū)的不同海拔高度，將暴露變量海拔高度從連續(xù)變量轉(zhuǎn)換為分類變量,根據(jù)海拔高度不同分為3組：(低值組(257～996 m)98個養(yǎng)殖場、中值組(1 002～1 287 m)98個養(yǎng)殖場、高值組(1 288～2 338 m)98個養(yǎng)殖場。并比較不同海拔之間的基線變異性。采用易侕統(tǒng)計軟件和R語言對294個養(yǎng)殖場H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況進行差異性分析。不同海拔對H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況差異統(tǒng)計結(jié)果顯示，不同海拔對H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫抗體水平影響差異不顯著(P>0.05)(圖5)。中海拔地區(qū)H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率高于低海拔和高海拔地區(qū)，表明貴州省具備的天然海拔條件有利于H7亞型AIV和NDV的免疫防控。

圖5 不同海拔對H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率的影響

2.6 多因素對H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況分析采用線性回歸模型對294個養(yǎng)殖場的H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫情況與不同地區(qū)、養(yǎng)殖方式、溫度和海拔等因素進行分析。結(jié)果顯示，以安順市H5亞型AIV疫苗免疫情況為參照對象，其他地區(qū)在近4年內(nèi)H5亞型AIV疫苗抗體陽性率均低于安順市；以規(guī)?；B(yǎng)殖場的H5亞型AIV疫苗免疫情況為參照對象，散養(yǎng)戶的H5亞型AIV疫苗抗體陽性率顯著低于規(guī)?；B(yǎng)殖場(P<0.05)；溫度和海拔對H5亞型AIV疫苗免疫抗體陽性率的影響差異不明顯。以安順市的H7亞型AIV疫苗免疫情況為參照對象，除貴陽市和畢節(jié)地區(qū)外，其余地區(qū)的H7亞型AIV疫苗免疫抗體陽性率均低于安順市；以規(guī)模化養(yǎng)殖場的H7亞型AIV疫苗免疫情況為參照對象，規(guī)模化養(yǎng)殖場比散養(yǎng)戶H7亞型AIV疫苗免疫抗體陽性率高；溫度和海拔對H7亞型AIV疫苗免疫抗體陽性率的影響差異不明顯。以安順市的NDV疫苗免疫情況為參照對象，其余地區(qū)的NDV疫苗免疫抗體陽性率均低于安順市；以規(guī)模化養(yǎng)殖場的NDV疫苗免疫情況為參照對象，規(guī)?；B(yǎng)殖場比散養(yǎng)戶NDV疫苗免疫抗體陽性率高；溫度和海拔對NDV疫苗免疫抗體水平影響差異不顯著(表1)。表明近4年以來H5,H7亞型AIV和NDV疫苗免疫抗體陽性率在各個地區(qū)均不穩(wěn)定；養(yǎng)殖方式、溫度和海拔對上述疫病的免疫效果影響不同。

表1 多因素對H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率的影響

3 討論

H5,H7亞型AIV和NDV入侵貴州省的養(yǎng)禽業(yè)多年，造成了巨大的經(jīng)濟損失，疫苗免疫是所有防控措施中最有效的一種。從本次統(tǒng)計看，貴州省2015—2018年檢測的H5,H7亞型AIV和NDV(共11 017份雞血清)的免疫抗體陽性率分別為84.80%(5541/6534),64.95%(871/1341)和90.48%(2 843/3 141)，NDV免疫抗體陽性率高于H5和H7亞型AIV，且NDV和H5亞型AIV免疫抗體陽性率均達到國家農(nóng)業(yè)部動物疫病監(jiān)測的標準，僅H7亞型AIV免疫抗體陽性率未達到國家農(nóng)業(yè)部動物疫病監(jiān)測的標準，反映出貴州省養(yǎng)禽業(yè)免疫管理基本符合規(guī)范，在疫苗免疫工作方面取得了較好的效果。而銅仁市、黔南州、六盤水市和黔東南州的H7亞型AIV免疫抗體陽性率分別為14%(7/50),19.63%(21/107),39.53%(134/339)和59.38%(95/160)，六盤水市H5亞型AIV免疫抗體陽性率為65.18%(511/784)，這些地區(qū)的疫苗免疫抗體陽性率均未達到國家免疫標準，建議加強監(jiān)測、及時補免。

通過對貴州省2015—2018年H5,H7亞型AIV和NDV免疫情況分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體差異較大，可能與各地區(qū)養(yǎng)殖方式、溫度和海拔等因素相關(guān)。H5亞型AIV免疫抗體陽性率高于H7亞型AIV且規(guī)模場免疫抗體陽性率高于散養(yǎng)戶，與徐佳等[13]報道黑龍江省禽流感免疫抗體監(jiān)測與分析結(jié)果相符。不同養(yǎng)殖方式對H5亞型AIV的免疫效果影響差異顯著(P<0.05)，而對H7亞型AIV和NDV的免疫效果影響無明顯差異。規(guī)?；B(yǎng)雞場的H5,H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率均高于散養(yǎng)戶，與康紅等[18]報道分析進賢縣雞場H5亞型禽流感不同檢測場抗體合格情況相符。按照溫度分層，低溫、中溫和高溫時H5亞型AIV免疫抗體陽性率分別為：85%,72%和89%；低溫、中溫和高溫時H7亞型AIV免疫抗體陽性率分別為：63%,66%和77%；低溫、中溫和高溫時NDV免疫抗體陽性率分別為90%,95%和87%。溫度對H5亞型AIV免疫抗體陽性率的影響差異極顯著(P<0.01)，冬季溫度較低，免疫合格率較夏季低，提示應(yīng)加強秋防免疫；而NDV免疫抗體情況剛好與H5,H7亞型AIV相反，春季免疫合格率較夏季和秋季低，與王娟娟等[18]報道的春防禽流感免疫抗體合格率高于秋防，而春防NDV免疫抗體合格率低于秋防相符。

貴州省的海拔高度由147.8 ～2 900.6 m不等，平均海拔在1 100 m左右。中海拔地區(qū)(1 002～1 287 m)H7亞型AIV和NDV免疫抗體陽性率明顯高于低海拔和高海拔地區(qū)，表明貴州省具備的天然海拔條件有利于雞H7亞型AIV和NDV的免疫防控。綜合來看，溫度和海拔對疫苗免疫效果的影響較大，貴州省H7亞型AIV免疫抗體不達標的地區(qū)主要是六盤水市和銅仁市。六盤水市因平均海拔最高，平均溫度最低；銅仁市因平均海拔最低，平均溫度最高，均不利于H7亞型AIV疫苗接種。因此在接種疫苗時，應(yīng)把飼養(yǎng)溫度控制在適宜免疫溫度，并做到規(guī)范操作和嚴格的消毒處理，對疫苗、管理水平和飼養(yǎng)環(huán)境等方面進行全面監(jiān)控，才能有效減少免疫失敗或免疫副作用的產(chǎn)生。貴州省冬春季的溫度明顯低于夏秋季，在以后的免疫中應(yīng)科學把控好免疫時間，本統(tǒng)計分析結(jié)果也符合國家“春防和秋防”的免疫方針，再次證實了該政策的科學性。

本研究通過R語言分析近4年來貴州省不同地區(qū)、養(yǎng)殖方式、溫度和海拔對H5,H7亞型AIV和NDV等疫病的免疫抗體陽性率的影響，為貴州省制定適合于本省的免疫程序和防控雞H5,H7亞型AIV和NDV提供理論依據(jù)。