豬薩佩羅病毒原位雜交檢測(cè)方法的建立

焦 哲，梁繼翔，嚴(yán)治山，劉曉麗，谷長(zhǎng)勤，胡薛英，程國(guó)富，張萬(wàn)坡

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

豬薩佩羅病毒(porcine sapelovirus，PSV)是小RNA病毒科薩佩羅病毒屬的一類(lèi)無(wú)囊膜球形單股正鏈RNA病毒，主要通過(guò)糞—口傳播，引起腹瀉、肺炎、繁殖障礙等多系統(tǒng)綜合征或無(wú)明顯特征的亞臨床癥狀[1]。PSV可與豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒、腸道病毒等混合感染導(dǎo)致病豬臨床癥出現(xiàn)非典型癥狀[2-5]。由于PSV隱性感染以及混合感染往往使其造成的癥狀被掩蓋而被忽略，造成PSV感染擴(kuò)散，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大威脅[6]。目前PSV普遍存在國(guó)內(nèi)規(guī)?；i場(chǎng)中，華南、華東、西南等地豬場(chǎng)均有檢出，因此檢測(cè)PSV對(duì)其感染相關(guān)疾病的診斷十分重要[7]。原位雜交是目前最為有效的分子病理學(xué)、分子遺傳學(xué)技術(shù)之一，但目前為止國(guó)內(nèi)暫無(wú)PSV的原位雜交檢測(cè)方法的報(bào)道[8]。本研究建立了一種豬薩佩羅病毒的原位雜交檢測(cè)方法，為豬薩佩羅病毒在感染仔豬后器官和組織中病毒核酸分布及致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒株及抗體豬薩佩羅病毒及鼠抗PSV多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 動(dòng)物試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)遵循《湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》中的規(guī)定，將經(jīng)PSV RT-PCR檢測(cè)陰性的21日齡的斷奶仔豬分成2組，每組3頭。感染組仔豬口服15 mL的 1×107TCID50/mL的PSV毒株，未感染組仔豬口服等量DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照。仔豬在接種后3 d后處死取其小腸組織甲醛固定后石蠟包埋。

1.3 主要試劑及儀器Easy Pure Viral DNA/RNA Kit試劑盒為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I，購(gòu)自美國(guó)Roche公司；原位雜交儀購(gòu)于美國(guó)StaSpinAbboaThermoBrite；Gel Extraction Kit購(gòu)自O(shè)mega公司；Phanta Max Master Mi購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上PSV的基因組序列，針對(duì)該病毒5′UTR基因序列利用DNAstar軟件設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物。采用BLAST工具初步驗(yàn)證該引物的特異性。所設(shè)計(jì)的特異性上、下游引物序列分別為Sapelovirus-F:5′-ACACTCATTTCCCCCCTCCA-3′，Sapelovirus-R:5′- CGCCGAAGCGCGTCGCTAAC-3′，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段的長(zhǎng)度為200 bp。上述引物由生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5 特異性探針的制備

1.5.1病毒RNA提取 取PSV病毒液200 μL，按全式金公司Easy Pure Viral DNA/RNA Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提，病毒核酸抽提液立即用M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行cDNA的合成。

1.5.2PCR擴(kuò)增目的條帶 取1.5 μL cDNA用設(shè)計(jì)好的引物(F/R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，使用OMEGA公司DNA凝膠回收試劑盒回收特異的目的擴(kuò)增片段。

1.5.3DNA探針的標(biāo)記 使用分光光度計(jì)測(cè)定PCR回收產(chǎn)物濃度后，取1 μg PCR回收產(chǎn)物按Roche公司地高辛標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA探針標(biāo)記。

1.6 原位雜交常規(guī)制作石蠟切片，參照文獻(xiàn)[9]對(duì)石蠟切片進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行探針的雜交和顯色，通過(guò)Nikon 80i生物光學(xué)顯微鏡和圖像采集系統(tǒng)觀察采集圖像，并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7 免疫組化為驗(yàn)證原位雜交結(jié)果準(zhǔn)確性，對(duì)ISH檢測(cè)的組織連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化，以鼠抗PSV一抗4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)羊抗鼠/兔IgG復(fù)合物作為二抗，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，中性樹(shù)膠封片后光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖像，并進(jìn)行結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果感染組仔豬在接種后第2天均出現(xiàn)腹瀉癥狀，采用孫杰等[10]建立的PSV RT-PCR方法對(duì)仔豬糞便進(jìn)行PSV核酸的檢測(cè)，檢測(cè)的感染組3頭仔豬糞便擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性，對(duì)照仔豬結(jié)果為陰性。

2.2 特異性探針的制備結(jié)果PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，紫外光檢測(cè)結(jié)果顯示，目的片段約為200 bp(圖1)，與預(yù)期大小是相符的。

圖1 PCR擴(kuò)增目的條帶結(jié)果 M.DL2000 Marker；1.PSV；2.陰性對(duì)照

2.3 PSV原位雜交結(jié)果地高辛標(biāo)記的DNA探針與組織內(nèi)PSV 的RNA特異性結(jié)合，經(jīng)NBT-BCIP顯色后呈藍(lán)紫色，感染組仔豬小腸大量絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)深藍(lán)紫色顆粒，雜交結(jié)果呈陽(yáng)性 (圖2A)，腸絨毛固有層也有散在的陽(yáng)性信號(hào)，陽(yáng)性細(xì)胞主要是淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(圖2B)；未感染PSV對(duì)照組未出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)(圖2C、D)。

圖2 PSV組織原位雜交結(jié)果 A、B.感染組小腸組織原位雜交結(jié)果；C、D.陰性對(duì)照組小腸組織原位雜交結(jié)果

2.4 PSV免疫組化結(jié)果對(duì)ISH檢測(cè)陽(yáng)性的連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化染色。結(jié)果顯示，陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色，位于小腸絨毛上皮細(xì)胞的胞質(zhì)中。觀察染色結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)這2種方法對(duì)PSV定位具有相同的結(jié)果(圖3)。

圖3 PSV組織免疫組化結(jié)果 A.感染組小腸組織原位雜交結(jié)果；B.連續(xù)切片免疫組織化學(xué)結(jié)果

3 討論

近年來(lái)，隨著養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化發(fā)展，豬病毒性腹瀉的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[11]。許多學(xué)者和專家認(rèn)為豬流行性腹瀉病毒、豬德?tīng)査跔畈《?、豬傳染性胃腸炎病毒等是引起該類(lèi)疾病的主要病原體[12]，而PSV等豬腸道病毒卻一直沒(méi)有引起重視，導(dǎo)致可供參考的豬腸道病毒研究資料甚少[13]。

本試驗(yàn)建立了組織中檢測(cè)PSV的原位雜交檢測(cè)方法，經(jīng)免疫組化檢測(cè)表明該方法具有很強(qiáng)的特異性，可用于PSV感染發(fā)病機(jī)制的研究和PSV實(shí)驗(yàn)室診斷。試驗(yàn)結(jié)果顯示，陽(yáng)性信號(hào)主要在感染組仔豬小腸大量絨毛上皮細(xì)胞內(nèi)，這與KIM等[14]對(duì)PSV的免疫組化定位結(jié)果一致，研究表明，PSV以表面受體唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(α2,3-Linked Sialic Acid on GD1a Ganglioside)為受體進(jìn)入宿主細(xì)胞，并且這類(lèi)受體在豬腸道組織具有較高的表達(dá)，因此相較于其他組織，腸道黏膜上皮對(duì)PSV更易感[15]。本研究結(jié)果顯示腸絨毛固有層中的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞胞漿也有散在的陽(yáng)性信號(hào)，這說(shuō)明小RNA病毒復(fù)制中間體是局灶性或彌漫性存在于這些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中[16]。

我們利用PSV病毒為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增的方法直接用地高辛標(biāo)記PCR產(chǎn)物合成PSV特異性探針，這種PSV特異性探針制備方法具有方便快捷的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)福爾馬林固定的組織進(jìn)行石蠟切片后與雜交的DNA探針相互作用，然后通過(guò)堿性磷酸酶標(biāo)記的報(bào)告抗體用酶促反應(yīng)顯示，可使用光學(xué)顯微鏡直接觀察，且ISH的優(yōu)點(diǎn)是永久性染色，信號(hào)不會(huì)隨著時(shí)間的推移而減少[17]。這種方法使用光學(xué)顯微鏡就可觀察結(jié)果，可以同時(shí)觀察組織形態(tài)且準(zhǔn)確地反映病毒在組織中的狀態(tài)與細(xì)胞的分布，具有較廣泛的應(yīng)用前景。