不同產(chǎn)地苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜和主成分分析

徐瀅 劉明穎 廖小菁 李瑤芳 王章偉 胡長(zhǎng)玲 劉地發(fā) 鄧雙炳

苦木,為苦木科苦樹(shù)屬植物Picrasma quassioides(D.Don)Benn.,藥用部位為干燥莖、枝和葉,性寒,味苦,有清熱解毒、祛濕的功效,主要用于風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛、濕熱瀉痢、蛇蟲(chóng)咬傷等癥[1]。苦木中的主要化學(xué)成分為生物堿類成分,苦味素類成分次之[2]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015年版一部、江西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)2014年版[3]、湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)2009年版[4]和廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)第三冊(cè)2018年版[5]中苦木質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均未收載指紋圖譜項(xiàng),苦木質(zhì)量研究報(bào)道多為單個(gè)或若干個(gè)生物堿的含量測(cè)定研究[6-7],作為可較為全面地表征中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的關(guān)于苦木枝的指紋圖譜的研究尚無(wú)報(bào)道。

根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)顯示,有147個(gè)藥品批文,其中包括苦木注射液、復(fù)方苦木消炎片、消炎利膽片等10個(gè)品種,129家企業(yè)使用到苦木藥材表明苦木的市場(chǎng)需求量很大?？嗄緦儆谝吧幉馁Y源,生長(zhǎng)周期長(zhǎng),且苦木莖、枝和葉的細(xì)胞組成差異較大,導(dǎo)致成分種類和成分含有量差異均較大[8],如何合理有效地利用苦木藥材具有重要意義。我國(guó)中藥制劑的質(zhì)量參差不齊,不同廠家的同中藥制劑、同廠家同中藥制劑,甚至同廠家同品種的不同批次之間的中藥制劑質(zhì)量差異都較大,除了因生產(chǎn)工藝差異較大和生產(chǎn)工藝參數(shù)不穩(wěn)定外,影響最大的就是藥材的質(zhì)量,因?yàn)椴煌a(chǎn)地、不同采收期、不同藥用部位的藥材化學(xué)成分的種類和成分含有量差異較大[9]。針對(duì)中藥制劑質(zhì)量差異大的現(xiàn)狀,有學(xué)者提出通過(guò)控制藥材質(zhì)量、不同批次藥材調(diào)配和不同批次提取物勾兌投料等方法[10],以實(shí)現(xiàn)不同批次中成藥制劑間質(zhì)量的穩(wěn)定均一。控制藥材質(zhì)量是實(shí)現(xiàn)不同批次藥材調(diào)配和提取物勾兌投料的前提,本文以10個(gè)產(chǎn)地10批苦木枝為研究對(duì)象,建立其指紋圖譜,通過(guò)兩種不同的相似度評(píng)價(jià)方法,采用主成分分析對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià),可為苦木的合理利用和質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀(安捷倫公司)；電子分析天平XS105DU、ML204T(梅特勒-托利多科技有限公司)；超聲清洗器KQ-300DE(昆山市超聲儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋HHS-11-2(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)。

1.2 軟件

中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版,國(guó)家藥典委員會(huì))；程度相似度評(píng)價(jià)軟件[11](1.0版,清華大學(xué)中藥現(xiàn)代化中心羅國(guó)安教授研究團(tuán)隊(duì)自主開(kāi)發(fā))；SPSS Statistics 21.0軟件(IBM)。

1.3 材料

乙腈(HPLC,TEDIA公司),冰醋酸、無(wú)水乙醇(均為分析純,廣東光華科技股份有限公司),鹽酸(分析純,西隴化工股份有限公司),水為超純水 (Mili-Q 自 制)。 1-甲 酸-6-羥 基-β-咔 巴 啉(6-hydroxy-β-carboline-1-carboxylic,20160607)、4,5-二甲氧基鐵屎米酮(4,5-dimethoxycanthin-6-one,20170912WS)、 1-甲 酸-β-咔 巴 啉 ( β-carboline-1-carboxylic acid,20171019WS)、3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮(3-methylcanthin-5,6-dione,20160630)、4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮(5-hydroxy-4-methoxylcanthin-6-one,20170901WS)均為自制,經(jīng)光譜學(xué)鑒定結(jié)構(gòu),質(zhì)量平衡法檢測(cè)其含量分別為94.0%、99.7%、98.1%、96.0%、98.8%[12]。10個(gè)產(chǎn)地苦木枝樣品共10批,由復(fù)旦大學(xué)胡長(zhǎng)玲博士采自各產(chǎn)地(見(jiàn)表1),經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所龔洵研究員鑒定為苦木科苦樹(shù)屬植物苦木Picrasma quassioides的枝,于江西青峰藥業(yè)有限公司留存。

表1 10批苦木枝樣品產(chǎn)地

1.4 色譜條件

Phenomenex Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相0.2%冰醋酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～9分鐘,15%→18%B；9～12分鐘,18%→21%B；12～15分鐘,21%→30%B；15～20分鐘,30%→36%B；20～25分鐘,36%→50%B；25～40分鐘,50%→90%B；40～45分鐘,90%→15%B)；后運(yùn)行10分鐘；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm,進(jìn)樣量20 μL。

1.5 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取 1-甲酸-6-羥基-β-咔巴啉、4,5-二甲氧基鐵屎米酮、1-甲酸-β-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮和 4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮約10 mg,于100 mL量瓶中,加2%鹽酸溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到對(duì)照品溶液貯備液；再精密移取上述溶液1 mL,于25 mL量瓶中,加2%鹽酸稀釋至刻度,搖勻,即得。

1.6 供試品溶液的制備

取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)約1.0 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%乙醇50 mL,超聲處理30分鐘,放置至室溫,搖勻,濾過(guò)。將上述濾液置蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,用2%的鹽酸10 mL分三次溶解提取物,并轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中,超聲10分鐘使之溶解,加2%鹽酸稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

1.7 方法學(xué)考察

1.7.1 儀器精密度試驗(yàn) 取同一苦木枝(S1),按“1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以18號(hào)峰為參照峰,測(cè)得共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%,表明儀器精密度良好。

1.7.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一苦木枝(S1)6份,按“1.6”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,按“1.4”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,以18號(hào)峰為參照峰,測(cè)得共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%,表明本方法重復(fù)性良好。

1.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一苦木枝(S1),按“1.6”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.4”項(xiàng)下色譜條件分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、16小時(shí)、20小時(shí)、24小時(shí)進(jìn)樣,以18號(hào)峰為參照峰,測(cè)得共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD均小于3.0%,表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2 結(jié)果

2.1 苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜測(cè)定

分別取10批不同產(chǎn)地的苦木枝,按“1.6”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液,按“1.4”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,記錄色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)對(duì)所得譜圖進(jìn)行處理,共標(biāo)記24個(gè)共有峰,且共有峰占比大于90%。經(jīng)與對(duì)照品溶液保留時(shí)間和紫外吸收特征圖譜比對(duì),確認(rèn)樣品圖譜中3號(hào)峰為1-甲酸-6-羥基-B-咔巴啉、6號(hào)峰為1-甲酸-B-咔巴啉、8號(hào)峰為3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮、18號(hào)峰為4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮、23號(hào)峰為4,5-二甲氧基鐵屎米酮。4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮為苦木枝主要活性成分,且其峰面積較大,與相鄰色譜峰分離度較好,因此選擇4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮(18號(hào)峰)為參照峰。以S1號(hào)色譜圖為參照譜圖,采用中位數(shù)法,時(shí)間窗為0.1,多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配生成對(duì)照?qǐng)D譜,見(jiàn)圖1～2。

圖1 對(duì)照指紋圖譜

圖2 10批苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜

2.2 相似度評(píng)價(jià)

將10批苦木枝色譜圖導(dǎo)入中藥色譜圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版),以“2.1”項(xiàng)中生成對(duì)照?qǐng)D譜,進(jìn)行相似度評(píng)價(jià),10批樣品相似度均大于0.9,說(shuō)明10個(gè)產(chǎn)地整體上一致性較好,但是從譜圖上來(lái)看20～26分鐘這個(gè)時(shí)間段上各產(chǎn)地在成分的種類和含量上有較大的差別。因此以“2.1”項(xiàng)中生成對(duì)照?qǐng)D譜的共有峰面積為對(duì)照,將其和10批樣品共有峰面積按照保留時(shí)間順序?qū)氤潭认嗨贫仍u(píng)價(jià)系統(tǒng)(1.0版)中,得到各批次的程度相似度。

結(jié)果顯示,10批樣品相似度大于0.9,程度相似度大于0.7,表明10個(gè)產(chǎn)地的苦木枝化學(xué)成分一致性較好。廣東英德、廣西河池、廣西梧州、貴州都勻和江西贛州的兩種相似度值較其余5個(gè)產(chǎn)地的高,表明該5批相似度較高,對(duì)對(duì)照?qǐng)D譜貢獻(xiàn)率較高。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 主成分分析

主成分分析是較為常用的多指標(biāo)、多變量降維的分析方法,可用于中藥材綜合質(zhì)量的評(píng)價(jià)。為了更好地評(píng)價(jià)樣品,將10批苦木枝共有峰峰面積通過(guò)SPSS Statistics 21.0軟件標(biāo)準(zhǔn)化描述后,通過(guò)降維中的因子分析,計(jì)算相關(guān)系數(shù)矩陣、主成分特征值、累計(jì)貢獻(xiàn)率和主成分綜合得分等,結(jié)果見(jiàn)表3、表4、圖3和圖4。

表2 10批苦木枝相似度結(jié)果

表3 特征值和方差貢獻(xiàn)率

以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn),得到前2個(gè)主成分的累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.358%,代表苦木枝中24個(gè)成分量92.358%的信息量,具有很好的代表性,可代表苦木枝的質(zhì)量。從表4可以得出,第1主成分信息主要來(lái)源于色譜峰 2、3、6、8、9、12、16 ～18、20、24,其中色譜峰3、8、18影響較大,分別為1-甲酸-6-羥基-B-咔巴啉、3-甲基-鐵屎米-5,6-二酮和 4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮,均為苦木的活性成分,其中4-甲氧基-5-羥基鐵屎米酮為其主要活性成分；第2類主成分信息來(lái)源于色譜峰 1、7、10、11、23；第 3 類主成分信息來(lái)源于色譜峰13。根據(jù)各主成分載荷向量除以各主成分特征值的算術(shù)平方根計(jì)算得到各批次的綜合得分。主成分分析結(jié)果顯示,廣東英德、廣西河池、廣西梧州、貴州都勻和江西贛州的5批苦木枝成分含有量較其余5批的高,其中S2綜合得分最好,質(zhì)量最好。綜合得分結(jié)果,程度相似度、相似度結(jié)果一致,表明主成分分析可以更加直觀的評(píng)價(jià)苦木枝的質(zhì)量,與兩種相似度的結(jié)果形成互補(bǔ)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 初始因子載荷矩陣

圖3 公共因子碎石圖

圖4 樣品在3個(gè)主成分的平面分布圖

表5 主成分得分和綜合得分

3 討論

中藥制劑和中藥材為多組分復(fù)雜體系,中藥材質(zhì)量的穩(wěn)定可靠是中藥制劑質(zhì)量穩(wěn)定可靠的前提保障,中藥指紋圖譜[13]是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上,對(duì)中藥化學(xué)成分物質(zhì)基礎(chǔ)的一種整體表達(dá)方式,能較好地體現(xiàn)中藥材的復(fù)雜性和整體性,是一種有效的中藥材質(zhì)量分析手段。目前筆者未見(jiàn)對(duì)苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜的報(bào)道,本文首先通過(guò)對(duì)提取方式、提取溶劑、提取時(shí)間、溶劑倍數(shù)、檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相、色譜柱等進(jìn)行考察,綜合得到獲得苦木枝高效液相色譜法指紋圖譜的最佳提取方法和最佳色譜條件。

隨著化學(xué)計(jì)量學(xué)在藥學(xué)方面的不斷應(yīng)用,不少學(xué)者通過(guò)對(duì)中藥指紋圖譜進(jìn)行主成分分析研究[14-15],可以更好地分析指紋圖譜的數(shù)據(jù),從而更加直觀地表征中藥的特征。本文通過(guò)相似度評(píng)價(jià)、程度相似度評(píng)價(jià)和主成分分析3種方式,對(duì)不同產(chǎn)地的苦木枝的24個(gè)共有峰進(jìn)行分析,結(jié)果表明10個(gè)產(chǎn)地的苦木枝化學(xué)成分均一性較好,但是作為主產(chǎn)地的廣東和廣西的成分含有量較高,綜合得分也較高,其中S2得分最高、質(zhì)量最好。表明地理位置和生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)藥材化學(xué)成分有一定的影響,地理位置較為接近的,化學(xué)成分較為一致,相似度較高,一定程度上證明道地藥材的重要性。本文通過(guò)指紋圖譜和主成分分析對(duì)不同產(chǎn)地苦木枝進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),可以更加直觀地評(píng)價(jià)苦木枝的質(zhì)量,可為苦木枝的質(zhì)量控制及其制劑的投料提供參考依據(jù)。