補(bǔ)腎活血方對兔NPMSCs移植治療退變椎間盤P38MAPK信號通路的影響

劉奕 陳曉峰 劉逸 蔡東嶺

腰痛,作為臨床常見病、多發(fā)病之一,據(jù)資料顯示,約80%人群存在不同程度腰腿疼痛癥狀,可影響患者日常生活及工作,對患者生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[1]；其病理改變的前提及基礎(chǔ)為腰椎間盤退變。腰椎間盤退變,引起脊柱生物力學(xué)改變,隨著細(xì)胞外基質(zhì)降解和椎間盤高度降低,髓核突出對脊神經(jīng)根或脊髓進(jìn)行壓迫,最終導(dǎo)致神經(jīng)不可逆損傷[2]。P38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶,是真核細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞反應(yīng)的一類重要信號系統(tǒng),目前研究發(fā)現(xiàn)P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在椎間盤退變過程中可能處于樞紐地位,對炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān),其中基質(zhì)金屬蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP-3)、基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP-7)的表達(dá)在椎間盤退變組織中表達(dá)明顯增加[3]。但是,腰椎間盤退變是一個非常復(fù)雜的過程,如何使退變椎間盤再生修復(fù)成為生物學(xué)上研究的熱點(diǎn),也是臨床治療上的難點(diǎn)。本研究在中醫(yī)學(xué)思想指導(dǎo)下,發(fā)揮中醫(yī)特色,采用補(bǔ)腎活血方對兔髓核間充質(zhì)干細(xì)胞(nucleus pulposus-derived mesenchymal stem cells,NPMSCs)移植治療退變椎間盤,旨在探索補(bǔ)腎活血方聯(lián)合NPMSCs移植對P38MAPK信號通路的影響,為臨床診治退變椎間盤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

128只SPF級健康新西蘭大白兔,雌雄不限,兔齡6～12月,體重(2.54±0.28)kg,購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心,生產(chǎn)許可證號：SCXK粵2019-0002。在室溫、安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng),模擬晝夜光12小時輪換,供應(yīng)足量的食物和水。其中2只用于NPMSCs的獲取、純化及培養(yǎng),24只用于假手術(shù)組(A組)；余102只兔退變椎間盤模型造模過程中死亡2只,成功造模100只,隨機(jī)選取48只為模型組(B組,24只)、補(bǔ)腎活血方組(C組,24只)；最后52只經(jīng)NPMSCs移植后死亡4只,余48只隨機(jī)分為NPMSCs移植組(D組,24只)、補(bǔ)腎活血方+NPMSCs移植組(E組,24只)。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人單克隆抗體 P38MAPK、MMP-3、MMP-7免疫組化試劑盒購自上海信裕生物科技有限公司。組織脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)、攤片機(jī)、烘片機(jī)、顯微鏡均為廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

1.3 NPMSCs的獲取、純化及培養(yǎng)

取2只健康成年新西蘭大白兔,采用空氣栓塞法處死,在無菌條件下取其肱骨、股骨、脛骨,將其放入超凈臺中,用無菌剪將骨骼從中間剪斷,然后用裝有5 mL的DMEM培養(yǎng)基的注射器針頭插入骨髓腔,反復(fù)沖洗,收集骨髓混合液。然后依次將骨髓混懸液離心、培養(yǎng),并用倒置顯微鏡觀察NPMSCs的形態(tài)及貼壁及生長情況。具體操作參考文獻(xiàn)[4]。

1.4 補(bǔ)腎活血方浸膏的制備

補(bǔ)腎活血方由11味藥物組成：骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、狗脊、熟地黃、牛膝、當(dāng)歸、羌活、獨(dú)活、紅花、木瓜、川芎按2∶2∶2∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1∶1組成,藥物劑量共132 g。具體制備方法參照文獻(xiàn)[4]：以上藥物加入20倍量的水煎煮兩次,1.5小時/次,過濾,濾液以薄膜蒸發(fā)濃縮,至相對密度0.9～1.1(80℃)的浸膏,浸膏含生藥量為1 g/mL(藥物濃度為1 g/mL)。保存于4℃冰箱中備用。

1.5 兔退變椎間盤模型制備及NPMSCs移植方法

兔退變椎間盤模型制備參考文獻(xiàn)[4],將兔直立在直徑110 mm的PVC管中,每天連續(xù)固定5小時,連續(xù)8周；然后采用1.5 T核磁共振(美國GE公司生產(chǎn))進(jìn)行掃描,掃描參數(shù)(TR3000 ms,TE135 ms,層厚5 mm,層距1 mm),由放射科2位主治或以上醫(yī)師閱片；參照Thompson分級法[5]進(jìn)行評估,選取中度信號減弱(3級)的模型兔為受試對象。

NPMSCs移植方法參考文獻(xiàn)[4],注射入的NPMSCs均使用第三代細(xì)胞,首先對受試動物耳緣靜脈采用3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉,待麻醉成功后,將其左側(cè)仰臥位固定于手術(shù)臺,然后對術(shù)區(qū)備皮、消毒、鋪單,顯露椎體及椎間盤,取L4-5、L5-6椎間盤用于實驗。用10 mL的注射器穿刺進(jìn)入椎間盤內(nèi)約5 mm,負(fù)壓抽吸髓核,其中L4-5椎間盤不注入任何物質(zhì),采用10 mL注射器負(fù)壓抽吸髓核；L5-6椎間盤1 mL注射器注入NPMSCs細(xì)胞懸液約0.5 mL(細(xì)胞濃度為1×106mL)；然后依次縫合大白兔肌肉、皮膚。待動物蘇醒后送回籠內(nèi)飼養(yǎng),術(shù)后予以每天一次肌注青霉8萬單位/次,連續(xù)3天。

1.6 給藥

大兔灌胃方法,參考文獻(xiàn)[6],大白兔每日灌胃用藥量=成人每日用藥量/正常成人體重×換算常數(shù)×校正系數(shù),按1 mL/(kg·d)灌胃大兔。A組：予生理鹽水灌胃,3次/天；同時采用NPMSCs移植方法注射0.9%生理鹽水0.5 mL,共1次。B組：給藥同A組。C組：予補(bǔ)腎活血方浸膏灌胃,3次/天；同時采用NPMSCs移植方法注射0.9%生理鹽水0.5 mL,共1次。D組：予生理鹽水灌胃,3次/天；同時采用NPMSCs移植,共1次。E組：予補(bǔ)腎活血方侵膏灌胃,3次/天；同時采用NPMSCs移植,共1次。

以上5組觀察時間點(diǎn)為治療前、治療后1周、治療后2周、治療后3周。

1.7 觀察指標(biāo)與檢測方法

免疫組織化學(xué)染色分別于治療前、治療后1周、治療后2周、治療后3周時采用空氣栓塞法處死各組大兔,每組每個時間點(diǎn)分別取6只(5組共30只)、5組4個時間段共120只大兔椎間盤；然后采用10%甲醛固定、EDTA脫鈣、石蠟包埋、切片(層厚約4～6 μm)。采用酶聯(lián)免疫法對椎間盤組織中P38MAPK、MMP-3、MMP-7含量進(jìn)行測定,嚴(yán)格按試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0處理,本研究數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布、方差齊,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行比較。以α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大兔不同時間段椎間盤組織中P38MAPK蛋白相對表達(dá)比較

各組變化趨勢：A組、B組在治療前、治療后1周、治療后2周、治療后3周4個時間點(diǎn)P38MAPK蛋白相對表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；C組、D組、E組P38MAPK蛋白相對表達(dá)在各時間點(diǎn)均呈下降趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

與A組比較,B組、C組、D組、E組P38MAPK蛋白相對表達(dá)在各時間點(diǎn)均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與B組比較,C組、D組、E組P38MAPK蛋白相對表達(dá)在治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),在治療后1周、2周、3周均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與C組比較,D組P38MAPK蛋白相對表達(dá)在各時間點(diǎn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；E組P38MAPK蛋白相對表達(dá)在治療后1周、2周、3周均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與D組比較,E組P38MAPK蛋白相對表達(dá)在治療后1周、2周、3周均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。 見表1。

2.2 各組大兔不同時間段椎間盤組織中MMP-3蛋白相對表達(dá)比較

各組變化趨勢：A組、B組在治療前、治療后1周、治療后2周、治療后3周時4個時間點(diǎn)MMP-3蛋白相對表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；C組、D組、E組MMP-3蛋白相對表達(dá)在各時間點(diǎn)均呈下降趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

與A組比較,B組、C組、D組、E組MMP-3蛋白相對表達(dá)在各時間點(diǎn)均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與 B組比較,C組、D組、E組 MMP-3蛋白相對表達(dá)在治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),在治療后1周、2周、3周均低于同期B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與C組比較,D組MMP-3蛋白相對表達(dá)在各時間點(diǎn)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)；E組MMP-3蛋白相對表達(dá)在治療后1周、2周、3周均低于同期C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與D組比較,E組MMP-3蛋白相對表達(dá)在治療后1周、2周、3周均低于同期D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

2.3 各組大兔不同時間段椎間盤組織中MMP-7蛋白相對表達(dá)比較

各組變化趨勢：A組、B組在同組治療前、治療后1周、治療后2周、治療后3周時4個時間點(diǎn)MMP-7蛋白相對表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；C組、D組、E組MMP-7蛋白相對表達(dá)在各時間點(diǎn)均呈下降趨勢,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

與A組比較,B組、C組、D組、E組MMP-7蛋白相對表達(dá)在各時間點(diǎn)均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與 B組比較,C組、D組、E組 MMP-7蛋白相對表達(dá)在治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),在治療后1周、2周、3周均低于同期B組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與C組比較,D組MMP-7蛋白相對表達(dá)在同期各時間點(diǎn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；E組MMP-7蛋白相對表達(dá)在治療后1周、2周、3周均低于同期C組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。與D組比較,E組MMP-7蛋白相對表達(dá)在治療后1周、2周、3周均低于同期D組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表3。

表1 各組大兔不同時間段椎間盤組織中P38MAPK蛋白相對表達(dá)比較(±s)

表1 各組大兔不同時間段椎間盤組織中P38MAPK蛋白相對表達(dá)比較(±s)

注：與假手術(shù)組比較aP＜0.01,與模型組比較bP＜0.01,與補(bǔ)腎活血方組比較cP＜0.01,與NPMSCs移植組比較dP＜0.01。

組別 兔數(shù) 治療前 治療后1周 治療后2周 治療后3周A組0.19±0.03 0.20±0.03 0.20±0.02 0.21±0.04 B 組 6 0.64±0.05a 0.67±0.04a 0.68±0.03a 0.67±0.04a C 組 6 0.63±0.04a 0.58±0.05ab 0.51±0.04ab 0.44±0.05ab D 組 6 0.64±0.04a 0.59±0.04ab 0.50±0.06ab 0.42±0.04ab E 組 6 0.64±0.02a 0.52±0.06abcd 0.41±0.05abcd 0.34±0.06 6 abcd

表2 各組大兔不同時間段椎間盤組織中MMP-3蛋白相對表達(dá)比較(±s)

表2 各組大兔不同時間段椎間盤組織中MMP-3蛋白相對表達(dá)比較(±s)

注：與假手術(shù)組比較aP＜0.01,與模型組比較bP＜0.01,與補(bǔ)腎活血方組比較cP＜0.01,與NPMSCs移植組比較dP＜0.01。

組別 兔數(shù) 治療前 治療后1周 治療后2周 治療后3周A組101.5±9.4 100.7±10.5 103.2±9.7 103.7±10.5 B 組 6 239.7±16.3a 242.4±15.1a 243.6±16.0a 243.0±15.8a C 組 6 240.6±17.2a 214.3±18.0ab 192.5±15.6ab 175.4±16.7ab D 組 6 238.5±18.6a 212.4±18.7ab 193.8±16.2ab 174.0±17.5ab E 組 6 239.0±17.4a 199.5±20.4abcd 172.3±15.8abcd 146.7±18.2 6 abcd

表3 各組大兔不同時間段椎間盤組織中MMP-7蛋白相對表達(dá)比較(±s)

表3 各組大兔不同時間段椎間盤組織中MMP-7蛋白相對表達(dá)比較(±s)

注：與假手術(shù)組比較aP＜0.01,與模型組比較bP＜0.01,與補(bǔ)腎活血方組比較cP＜0.01,與NPMSCs移植組比較dP＜0.01。

組別 兔數(shù) 治療前 治療后1周 治療后2周 治療后3周A 組 6 110.8±12.3 111.5±11.7 110.4±10.8 112.6±12.0 B 組 6 386.7±27.3a 387.9±26.5a 389.5±27.1a 389.4±26.8a C 組 6 387.8±25.9a 312.1±26.4ab 270.7±25.2ab 206.8±24.1ab D 組 6 389.6±26.5a 310.5±24.8ab 269.5±26.7ab 204.2±25.8ab E 組 6 387.5±27.7a 273.6±29.0abcd 224.3±26.4abcd 176.5±28.2abcd

3 討論

腰腿痛等脊柱相關(guān)疾病是勞動人群致殘的主要原因[7],其病理改變的前提及基礎(chǔ)為腰椎間盤退變。椎間盤中含豐富的細(xì)胞外基質(zhì),其主要成分為水、膠原、蛋白多糖及少量彈性蛋白等；并且椎間盤內(nèi)各種降解酶和抑制物一般共同存在且呈潛伏狀態(tài)；正常情況下,胞外基質(zhì)處于不斷分解與合成的動態(tài)平衡之中,當(dāng)這一平衡破壞,可造成椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)成分改變,引起髓核脫水而失去固有彈性,逐漸使椎間盤內(nèi)環(huán)境及機(jī)械作用發(fā)生改變,最終導(dǎo)致椎間盤基質(zhì)分解,髓核突出對神經(jīng)根或脊髓進(jìn)行性壓迫,導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)產(chǎn)生不可逆損傷[3]。

研究顯示[3],P38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在椎間盤退變過程中可能處于樞紐地位,對炎癥、應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控密切相關(guān),其中MMP-3、MMP-7的表達(dá)在椎間盤退變組織中表達(dá)明顯增加。提示基質(zhì)金屬蛋白酶對椎間盤退變發(fā)揮重要調(diào)控作用?；|(zhì)金屬蛋白酶,為細(xì)胞外重要的降解酶類,能夠激活細(xì)胞因子、生長因子、抑制因子及椎間盤細(xì)胞；其中MMP-3、MMP-7是MMPs家族的成員之一,可降解Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅸ型膠原及軟骨中蛋白多糖中的核心蛋白,使糖蛋白和連接蛋白裂解為高度異質(zhì)性分子,影響椎間盤突出重吸收[8]。

研究顯示[9-11],髓核功能細(xì)胞數(shù)量減少和細(xì)胞外基質(zhì)(extral celluar matrix,ECM)合成減少是椎間盤退變中最重要的兩個表現(xiàn)；椎間盤生物學(xué)修復(fù)的關(guān)鍵所在是以髓核內(nèi)足夠的活力細(xì)胞為前提,進(jìn)而增加ECM的合成、修復(fù)或延緩椎間盤退變,目前以細(xì)胞為基礎(chǔ)修復(fù)椎間盤退變的動物實驗研究得到了一定成果。其中NPMSCs是一種來源于髓核組織的間充質(zhì)干細(xì)胞,其移植治療不但可以增加椎間盤原始細(xì)胞活力,而且還可以在髓核內(nèi)環(huán)境因素刺激下向髓核樣細(xì)胞分化,補(bǔ)充細(xì)胞數(shù),可起到修復(fù)椎間盤退變的效果[12-14]。

椎間盤退變,根據(jù)其臨床特征,可歸屬于祖國醫(yī)學(xué)“痹證”范疇,《內(nèi)經(jīng)》云：“腰為腎之腑?！蹦I虛為本,瘀血為標(biāo),治療上應(yīng)補(bǔ)腎活血通絡(luò)。補(bǔ)腎活血方是以骨碎補(bǔ)、補(bǔ)骨脂、狗脊為君藥,補(bǔ)腎壯骨；以熟地、牛膝、當(dāng)歸 、羌活、獨(dú)活為臣藥,以加強(qiáng)補(bǔ)腎之力,兼以祛風(fēng)止痛；輔以紅花、木瓜、川芎活血化瘀；采取的是“扶正祛邪,內(nèi)外同治”的治療原則,以達(dá)標(biāo)本兼治。梁龍等[15]研究表明,針對腰椎間盤突出癥患者,補(bǔ)腎活血法能顯著緩解患者的疼痛、改善其功能活動；楊屆等[16]研究指出補(bǔ)腎活血湯可抑制及P38MAPK蛋白的表達(dá),可延緩椎間盤退。

本研究結(jié)果表明,椎間盤退變兔椎間盤組織中P38MAPK、MMP-3、MMP-7蛋白相對表達(dá)均明顯增高,經(jīng)補(bǔ)腎活血方、兔NPMSCs移植、補(bǔ)腎活血方+兔NPMSCs移植干預(yù)的組別兔椎間盤組織中 P38MAPK、MMP-3、MMP-7蛋白相對表達(dá)均呈不同程度下降趨；其中,補(bǔ)腎活血方、兔NPMSCs移植治療退變椎間盤兔椎間盤組織中P38MAPK、MMP-3、MMP-7蛋白相對表達(dá)組間無差異,而補(bǔ)腎活血方+兔NPMSCs移植干預(yù)退變椎間盤兔組椎間盤組織中P38MAPK、MMP-3、MMP-7蛋白相對表達(dá)均低于補(bǔ)腎活血方、兔NPMSCs移植治療組,提示補(bǔ)腎活血方對兔NPMSCs移植治療退變椎間盤具有協(xié)同作用；其機(jī)制可能與抑制P38MAPK信號通路,下調(diào)MMP-3、MMP-7蛋白相關(guān)。