一株豬圓環(huán)病毒3型的全基因序列測定及遺傳進化分析

王雪濤 ，林艷，蔡雨涵，駱輝，陰文奇，李盛辟，周遠成*

（1.畜科生物工程有限公司，畜禽生物制品四川省重點實驗室，四川省動物生物制品工程技術研究中心，四川 成都 610200；2.四川省崇州市動物疫病預防控制中心，四川 崇州 611200）

豬圓環(huán)病毒（PCV）是一種小型單股環(huán)狀無囊膜的DNA病毒，根據(jù)基因及抗原的差異性將其分為3種血清型：豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）以及新出現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3）［1］。PCV1于1974年被Tischer I 等［2］在豬傳代細胞中發(fā)現(xiàn)，被認為是一種細胞污染物，直到1982年通過離心后電鏡觀察才首次確認命名［3］，該病毒對豬只沒有致病性。PCV2與豬圓環(huán)病毒?。≒CVAD）相關，能導致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、豬皮炎和腎病綜合征（PDNS）、繁殖障礙等疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的威協(xié)［4］。PCV3 是一種與豬皮炎和腎病綜合征、生殖功能衰竭和多系統(tǒng)炎癥相關的新型豬圓環(huán)病毒［1］。PCV3基因組全長為2 000 bp，GC含量50%，PCV3主要包括ORF1、ORF2、ORF3 三個開放閱讀框（ORFs），其中ORF1 與ORF2 分別編碼復制酶蛋白Rep 和抗原結構蛋白Cap，且兩個ORF 呈反向排列，ORF3 編碼231 個氨基酸蛋白，起始密碼子不清楚?；蚍治霭l(fā)現(xiàn)PCV3 與PCV2、PCV1 基因組之間的同源性較低，并且抗原蛋白Cap 之間不具有交叉保護性［5-6］。

2016 年，PCV3 首先在美國報道發(fā)現(xiàn)［7］，以后陸續(xù)在亞洲、歐洲、美洲的許多國家發(fā)現(xiàn)和流行。自2016 年以來，PCV3 已經在我國出現(xiàn)并流行［8-9］。PCV3 常與免疫抑制性病毒（PCV2 和PRRSV）以多重感染的形式被檢出［10］，在我國也通常以混合感染的形式出現(xiàn)［11］。本試驗通過對實驗室保存送檢的病料進行PCV3 陽性篩選、送檢測序，以及相關基因分析，為當前PCV3分子流行病學研究提供一定的參考。

1 材料

1.1 主要試劑 2×Taq MasterMix、DL2000 DNA Marker，均購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；病毒基因組DNA 提取試劑盒購自康寧生命科學（吳江）有限公司。

1.2 相關引物 PCV3的檢測采用常規(guī)PCR方法，參考GenBank 上PCV3 的基因序列，利用BioEdit軟件設計PCV3 的檢測引物（PCV3-Cap-F/R）和全基因引物（PCV3-全-F/R）。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息詳見表1。

表1 引物信息表

2 方法

2.1 樣品收集 將2019年四川各規(guī)模養(yǎng)殖場送檢的50 份病料，包括腹瀉仔豬的腸內容物、保育豬腹瀉糞樣、流產胎兒組織、木乃伊胎組織、繁殖障礙母豬血液、呼吸系統(tǒng)障礙和運動障礙育肥豬組織、腹瀉母豬糞樣等，前期已按照送檢要求對送檢樣品進行過其他病原（如CSFV、PRRSV、PRV、JEV、PPV、PCV2、TGEV、PEDV 等）的檢測，樣品放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCV3 檢測 將收集的50 份病料研磨破碎后，用核酸提取試劑盒提取DNA，以樣品中提取的DNA為模板，以設計好的檢測引物PCV3-Cap-F/R進行PCV3 PCR檢測。反應體系為20 μL：2×Taq MasterMix 10 μL，模板DNA 1.0 μL，PCV3-Cap-F 1.0 μL，PCV3-Cap-R 1.0 μL，ddH2O 7 μL。反應程序為：95 ℃2 min；95 ℃30 s，58 ℃45 s，72 ℃30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。

2.3 PCV3全基因組擴增 以檢測出的陽性核酸為模板，用全基因引物（PCV3-全-F/R）對陽性核酸進行PCV3全基因擴增，PCR反應體系為50 μL：2×Taq MasterMix 25 μL，模 板DNA 2.0 μL，PCV3-Cap-F 2.0 μL，PCV3-Cap-R 2.0 μL，ddH2O 19 μL。反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL 用1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。然后將剩余的45 μL送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

2.4 PCV3 基因組分析 將所得的PCV3 序列與NCBI 中的參考序列進行比對。從GenBank中挑選下載18 株PCV3 參考毒株，分別是9 株國外毒株和9株國內毒株（表2）。利用MAGA7.0軟件繪制Cap 蛋白基因序列的遺傳進化樹，并利用MegAlign 軟件對Cap 蛋白基因同源性和全基因同源性進行分析。

表2 18株PCV3參考毒株

3 結果

通過對實驗室保存病料的篩選、全基因組擴增和送檢測序，獲得了一株病毒全基因序列，經GenBank 的BLAST 比對，確定該序列為PCV3 全基因序列，基因組長度為2 000 bp，將其命名為PCV3/CN/Sichuan/2019。

為了分析PCV3/CN/Sichuan/2019與其他PCV3毒株的遺傳關系，基于抗原結構蛋白Cap基因序列，構建進化樹（圖1），結果顯示：本次獲得的毒株PCV3/CN/Sichuan/2019與國內河南毒株HeNYS-2（2017）的遺傳關系最近；從整個遺傳進化距離看，與國外毒株的遺傳關系較遠，與國內毒株（包括亞洲毒株PCV3-RU/TY17）的遺傳關系較近。Cap 蛋白基因序列同源性分析結果（圖2）表明，PCV3/CN/Sichuan/2019 與河南毒株HeNYS-2（2017）的同源性最高，為99.8%。與其余8 株國內毒株的同源性在99.1%～99.2%之間，與國外9株毒株的同源性在99.1%～99.3%之間。全基因序列同源性分析結果（圖3）表明，PCV3/CN/Sichuan/2019與河南毒株HeNYS-2（2017）的同源性為100%，與其余8 株國內毒株的同源性在98.1%～98.8%之間，與國外9 株毒株的同源性在98.0%～98.6%之間。

4 討論

圖1 PCV3/CN/Sichuan/2019與國內外毒株Cap基因序列的遺傳進化分析

圖2 PCV3/CN/Sichuan/2019與國內外毒株Cap基因序列的同源性比較

圖3 PCV3/CN/Sichuan/2019與國內外毒株全基因序列的同源性比較

PCV3 是近幾年才在豬群中發(fā)現(xiàn)的圓環(huán)病毒，目前尚未見報道分離到PCV3 活毒株。其相關研究還處于前期階段，致病性尚不清楚，臨床上常以混合感染的形式出現(xiàn)，這加大了疾病的診斷與防控，對養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害亟待評估。雖然目前的研究顯示PCV3與豬呼吸道疾病和腹瀉有潛在的關聯(lián)，但其感染機制、發(fā)病機理和生物學特性還需進一步研究，以確定PCV3 在健康豬中的影響［12-13］。

本試驗獲得的PCV3/CN/Sichuan/2019毒株的全基因序列與國內8株參考毒株全基因序列的同源性（98.1%～98.8%）高于與國外毒株全基因序列的同源性（98.0%～98.6%），Cap蛋白基因序列的同源性與國內外毒株基本相同（99.1%～99.3%）。從進化距離上看，與國內毒株的進化距離最近，與國外毒株的進化距離較遠，且該毒株與河南毒株HeNYS-2（2017）的進化距離最近，其全基因序列的同源性高達100%，Cap蛋白基因序列的同源性高達99.8%。說明從四川某豬場分離的PCV3毒株與河南毒株相同，該毒株的Cap 蛋白基因和其他基因都發(fā)生了一點突變；與其余國內外毒株的基因序列相比，Cap 基因序列的同源性高于全基因序列的同源性，說明Cap 基因發(fā)生的堿基突變率高于其他基因，但整體上看PCV3 毒株的變異小，基因遺傳進化特性穩(wěn)定。

本試驗從編碼Cap 蛋白的ORF2 基因和全基因序列角度對PCV3 進行了遺傳進化分析，希望可以為四川省PCV3的遺傳變異和流行病學研究提供理論依據(jù)。