沈楓 蔣洪波 劉博 張秀茹 劉軍 解文孝 姚繼攀 馬亮
(遼寧省水稻研究所, 沈陽 110101; *通信聯(lián)系人, E-mail: malhd@126.com)
水稻是世界上重要的主食作物,在100多個(gè)國(guó)家均有種植[1],種植面積約占世界耕地面積的11.5%[2]。稻米是人們攝取熱量、蛋白質(zhì)和微量元素的來源之一。稻米中微量營(yíng)養(yǎng)素不僅在水稻自身代謝和抵御逆境中發(fā)揮重要作用,也關(guān)系到人類營(yíng)養(yǎng)和健康[3-5]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活水平的提高,兼顧水稻產(chǎn)量的同時(shí)提高稻米品質(zhì)成為我國(guó)糧食生產(chǎn)的主要方向[6]。
目前針對(duì)稻米品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)元素有較多研究,包括稻米品質(zhì)的影響因素[7]、大米中酚類物質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[8]和次生代謝物的抗氧化活性[9]等。代謝組學(xué)(Metabolomics)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科[10],已成功應(yīng)用于稻米及食品科學(xué)研究領(lǐng)域。Feng等[11]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同水稻代謝物具有地域來源信息。Song等[12]對(duì)籽粒的代謝進(jìn)行分析并為提高稻谷的食味品質(zhì)提供新思路。Heuberger等[13]利用代謝組學(xué)選擇營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高和具有保健功能的水稻品種。
隨著消費(fèi)者和稻米市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)稻米青睞程度的上升,各國(guó)先后培育出一批優(yōu)質(zhì)食味水稻品種。日本是世界上研究稻米食味起步最早的國(guó)家[14],越光是日本最具有代表性的優(yōu)質(zhì)大米之一,尤其日本新潟縣生產(chǎn)的越光米更是久負(fù)盛名。遼寧省近年來育成了多個(gè)優(yōu)質(zhì)高食味常規(guī)粳稻和雜交粳稻品種,其中遼粳433在2013年全國(guó)優(yōu)良食味粳稻品評(píng)中榮獲一等獎(jiǎng),食味品質(zhì)分超過在遼寧種植的越光[15]。遼寧省東港市與日本新潟縣有類似的地理環(huán)境且緯度相近,是我國(guó)優(yōu)質(zhì)大米生產(chǎn)基地之一。本研究以種植在遼寧省東港市的遼粳433和越光為研究對(duì)象,用GC-MS技術(shù)測(cè)定其代謝產(chǎn)物,分析與營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的代謝產(chǎn)物,評(píng)價(jià)遼粳433的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
試驗(yàn)品種為遼粳433(遼星1號(hào)/幸實(shí)為母本,港源 8號(hào)為父本)和越光(Koshihikari)。種子由遼寧省水稻研究所提供。試材種植在遼寧省東港市,土壤基本理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)含量 16.7 g/kg,全氮含量11.2 g/kg,堿解氮含量109.36 mg/kg,速效磷含量10.73 mg/kg,速效鉀含量137.6 mg/kg,pH值6.6。
種子完全成熟后于2018年10月15日收獲,室溫自然風(fēng)干 3日,含水量控制在 13%~15%。每個(gè)品種6個(gè)處理,每個(gè)處理1穴,每穴稻谷經(jīng)脫殼后獲得糙米,液氮冷凍,-80℃下保存。
液氮冷凍的糙米放于液氮預(yù)冷的冷凍磨碎機(jī)中磨碎成粉末狀。精密稱取60 mg粉末樣本,放入1.5 mL的離心管中,360 μL的冷甲醇和40 μL的內(nèi)標(biāo)(0.3 mg/mL L-2-氯-苯丙氨酸),在-80℃冰箱中放置2 min,超聲提取30 min。加入200 μL的氯仿和400 μL的水,超聲提取30 min。離心10 min(12 000 r/min,4℃),取300 μL的上清液裝入玻璃衍生瓶中,用離心濃縮干燥器揮干樣本,向玻璃衍生小瓶中加入 80 μL的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液(15 mg/mL),37℃震蕩培養(yǎng)箱中肟化反應(yīng)90 min。再加入80 μL的BSTFA(含1% TMCS)衍生試劑和20 μL的正己烷,70℃下反應(yīng)60 min,室溫放置30 min。
使用美國(guó)安捷倫公司的7890B-5977A GC/MSD氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)樣品進(jìn)行GC-MS代謝組學(xué)分析。色譜條件如下:DB-5 MS毛細(xì)管柱(30 m × 0.25 mm×0.25 μm),載氣為高純氦氣,流速 1.0 mL/min,進(jìn)樣口的溫度為260℃。進(jìn)樣量1 μL,分流比4∶1,溶劑延遲5 min。質(zhì)譜條件如下:電子轟擊離子源(EI),離子源溫度230℃,四級(jí)桿溫度150℃,電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式(SCAN),質(zhì)量掃描范圍為m/z 50~500。為檢測(cè)這個(gè)分析過程的重復(fù)性,在每9個(gè)分析樣本中插入1個(gè)質(zhì)控樣本(等量取9個(gè)樣本混合)。
將 GC-MS原始數(shù)據(jù)經(jīng)軟件轉(zhuǎn)換,導(dǎo)入MS-DIAL軟件進(jìn)行峰識(shí)別,與公共數(shù)據(jù)庫Fiehn匹配相似度實(shí)現(xiàn)化合物定性,每種物質(zhì)在質(zhì)譜中的響應(yīng)信息經(jīng)過轉(zhuǎn)換得到豐度值即為相對(duì)定量值。
每個(gè)品種的 6個(gè)獨(dú)立樣本經(jīng)過在線軟件(http://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行品種間代謝物的PCA(principal components analyses)、PLS-DA(partial least-squares discrimination analysis)、t檢測(cè)和差異代謝通路分析[16]。
對(duì)遼粳433和越光的糙米進(jìn)行GC-MS檢測(cè),兩個(gè)品種的糙米中均定性到233種代謝產(chǎn)物,有機(jī)酸55種,碳水化合物及類似物65種,氨基酸類38種,次生代謝物30種,維生素類11種,核苷酸類11種,其他23種。遼粳433糙米代謝產(chǎn)物相對(duì)含量比越光高的有158種,占檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物總數(shù)的67.81%,包括有機(jī)酸39種,碳水化合物及類似物40種,氨基酸類22種,次生代謝物23種,維生素類7種,核苷酸類9種,其他18種。
圖1 遼粳433與越光糙米代謝產(chǎn)物之間PCA和PLS-DA分析Fig. 1. PCA and PLS-DA of metabolites of Liaojing 433 and Koshihikari.
利用在線軟件對(duì)遼粳433與越光糙米中代謝產(chǎn)物進(jìn)行PCA和PLS-DA分析。從PCA(圖1-A)和PLS-DA(圖1-B)分析圖中可見,主成分1分別解釋了總變異的22.4%和22.3%,遼粳433與越光糙米代謝物沿著主成分1明顯分離,說明遼粳433與越光糙米代謝物組成有明顯差異。模型擬合度參數(shù) R2值為 0.9669,Q2值為 0.7600,表明模型的預(yù)測(cè)能力較高。
利用變量權(quán)重(variable importance, VIP)進(jìn)行比較分析,用VIP>1.0進(jìn)行差異代謝產(chǎn)物鑒定,鑒定出遼粳433和越光的糙米之間存在顯著差異的代謝物49種。用t檢驗(yàn)法鑒定了兩個(gè)品種間P<0.01的顯著差異的代謝物,結(jié)果表明,遼粳433與越光糙米之間有39種代謝物含量有顯著差異(表1)。
綜合PLS-DA分析和t檢測(cè)差異代謝產(chǎn)物,遼粳433和越光糙米之間共有64種差異代謝產(chǎn)物,占總數(shù)的27.47%。包括16種有機(jī)酸(3-羥基苯甲酸、四氧酸、β-甘油磷酸、雙半乳糖醛酸、二十二碳烯酸、延胡索酸、半乳酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖酸、乳酸、乳糖酸、二十八酸、核糖-5-磷酸、琥珀酸、海藻糖-6-磷酸和尿酸)、13種碳水化合物及類似物(1,5-脫水葡萄糖醇、2-酮葡萄糖二甲基縮醛、6-脫氧葡萄糖、阿拉伯糖醇、β-甘露醇甘油酯、纖維二糖、1, 2, 3, 4, 5, 6, 6-氘代葡萄糖、甘油、磷酸甘油酯、帕拉金糖醇、核糖醇、三糖和木糖)、5種氨基酸(鳥氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸和賴氨酸)、6種維生素(α-生育酚、泛酸、肌醇、亞油酸、油酸和肌醇-4-單磷酸)、14種次生代謝物[1, 2, 4-苯三酚、3-羥基-3-(4'-羥基-3'-甲氧基苯基)丙酸、5-羥基-3-吲哚乙酸、5-甲氧色胺、胍基丁胺、兒茶素、綠原酸、己內(nèi)酰胺、阿魏酸、N-乙酰-D-己糖胺、N-乙酰半乳糖胺、苯乙酰胺、腐胺和奎寧酸)];核苷酸類2種(2-脫氧鳥苷和鳥苷)和其他8種[1-甲基海因、2-(哌啶基)苯甲腈、肌酐、胱硫醚、5-單磷酸胞苷、胞嘧啶、肌苷和辛烷醛]。
將兩個(gè)品種的差異代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA),如圖 2 所示,64種差異代謝產(chǎn)物被分為兩大簇,具有相對(duì)變化趨勢(shì)的代謝物聚在一起。1-甲基海因、辛烷醛、苯乙酰胺、肌醇-4-單磷酸、3-羥基苯甲酸、賴氨酸和阿拉伯糖醇等22種代謝產(chǎn)物聚為一類,表明遼粳433糙米中代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量低于越光糙米。這一組中與營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的代謝產(chǎn)物有阿拉伯糖醇、亞油酸、肌醇-4-磷酸、瓜氨酸、賴氨酸、N-乙酰-D-己糖胺和苯乙酰胺等。其他42種代謝產(chǎn)物歸為一類,表明遼粳433糙米中代謝產(chǎn)物的相對(duì)含量高于越光。這一組中與營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的代謝產(chǎn)物包括氨基葡萄糖酸、半乳糖醛酸、半乳糖酸、海藻糖-6-磷酸、山酸、三糖、木糖、纖維二糖、帕拉金糖、α-生育酚、泛酸、肌醇、油酸、Β-丙氨酸、4-氨基丁酸、鳥氨酸、1, 2, 4-苯三酚、奎尼酸、綠原酸、腐胺、N-乙酰半乳糖胺等。
表1 遼粳433與越光糙米之間差異代謝產(chǎn)物種類與數(shù)量Table 1. Different metabolic species and quantity between brown rice of Liaojing 433 and Koshihikari.
代謝通路分析表明(圖3),遼粳433和越光糙米的代謝產(chǎn)物之間有11條顯著差異代謝通路,包括賴氨酸生物合成、泛酸鹽和輔酶A生物合成、苯丙烷生物合成、肌醇磷酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、β-丙氨酸代謝、嘌呤代謝、酪氨酸代謝、色氨酸代謝和亞油酸代謝。由表2可見,肌醇磷酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、酪氨酸代謝和苯丙烷生物合成檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物相對(duì)含量均表現(xiàn)為遼粳433高于越光。
圖2 遼粳433和越光糙米的差異代謝產(chǎn)物聚類分析的熱圖Fig. 2. Heat map of cluster analysis on differential metabolites of brown rice between Liaojing 433 and Koshihikari.
圖3 遼粳433與越光的糙米差異代謝通路Fig. 3. Differential metabolic pathways between Liaojing 433 and Koshihikari.
代謝組學(xué)分析為農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)成分表征、差異性分析以及膳食結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了新的策略。有機(jī)酸影響食物的風(fēng)味[17],遼粳433和越光通過GC-MS分析鑒定出55種有機(jī)酸,遼粳433相對(duì)含量高于越光的有39種,其中氨基葡萄糖酸、半乳糖醛酸、半乳糖酸、海藻糖-6-磷酸、山酸相對(duì)含量分別是越光的23.86、19.97、2.54、8.51和10.79倍。氨基葡萄糖酸是遼粳433和越光之間差異最顯著的有機(jī)酸,它是功能性食品甜味劑和添加劑[18],也可與三價(jià)絡(luò)離子形成絡(luò)合物,降低體內(nèi)血糖[19]。海藻糖-6-磷酸是植物代謝與生長(zhǎng)發(fā)育的重要信號(hào)[20]。半乳糖酸是植物抗壞血酸生物合成途徑的重要前體[21],半乳糖醛酸是果膠的主要成分。高纖維飲食可以降低慢性疾病的發(fā)病率[22],維持腸道生態(tài)環(huán)境[23]。低聚糖對(duì)人、動(dòng)物、植物等具有特殊的生理作用[24]。遼粳433糙米中的三糖、木糖、纖維二糖、帕拉金糖分別是越光糙米中的 13.35、3.63、2.53和 3.20倍。阿拉伯糖醇具有保護(hù)牙齒的功能,越光糙米中阿拉伯糖醇是433糙米中1.61倍。維生素是人類維持正常的生理功能而必須從食物中獲得的一類微量有機(jī)物質(zhì)。遼粳433與越光糙米中差異維生素有6種,遼粳433糙米中α-生育酚、泛酸、肌醇和油酸分別是越光的2.66、2.90、3.54和9.32倍。越光糙米中亞油酸和肌醇-4-磷酸是遼粳433中的2.33倍和2.39倍。高含量的油酸能促進(jìn)人體脂質(zhì)代謝[25]、在膀胱癌、乳腺癌和胰島細(xì)胞凋亡等方面[26-27]都有正面作用。α-生育酚是一種有效的抗氧化劑[28],能降低血液中膽固醇水平,α-生育酚作為脂溶性維生素被美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)認(rèn)定為安全的食品添加劑[29]。泛酸是人體必需的維生素之一[30]。肌醇是棉子糖家族寡糖的重要前體物質(zhì)。4-氨基丁酸(GABA)被認(rèn)為是一種具有生物活性的植物代謝物,在調(diào)節(jié)血壓、改善睡眠、保護(hù)肝臟等方面有正面作用[31],GABA大米被認(rèn)為是具有保健功能的營(yíng)養(yǎng)米[32]。β-丙氨酸是自然界中存在的唯一一種β型氨基酸,是有益的膳食補(bǔ)充劑,也是世界范圍內(nèi)廣受歡迎的運(yùn)動(dòng)補(bǔ)充劑[33-34]。瓜氨酸能夠抑制運(yùn)動(dòng)引起的血氨升高[35]。遼粳433糙米中非必需氨基酸鳥氨酸、瓜氨酸、β-丙氨酸、4-氨基丁酸分別是越光的3.04、2.36、2.12和2.44倍。賴氨酸作為水稻第一限制性必需氨基酸[36],與蛋白質(zhì)含量正相關(guān),在一定范圍內(nèi)蛋白質(zhì)含量與食味品質(zhì)間呈顯著負(fù)相關(guān)[37-38],遼粳433的賴氨酸僅為越光和遼粳401的一半,本課題組多年測(cè)試結(jié)果表明遼粳433食味品質(zhì)分超過同一地區(qū)種植的越光[15],這與賴氨酸含量是否有明確的關(guān)系需要進(jìn)一步分析。次生代謝物含量與抗氧化能力呈正相關(guān)[39]。本研究共檢測(cè)到30種次生代謝產(chǎn)物,遼粳433糙米中含量高的有21種,其中遼粳433糙米中的1, 2, 4-苯三酚、奎尼酸、綠原酸、腐胺、N-乙酰-D-己糖胺是越光的 2.37、4.05、2.10、1.46和 2.04。越光糙米中苯乙酰胺是遼粳433的1.77倍。1, 2, 4-苯三酚除具有清除自由基的能力,還可以抑制血紅素誘導(dǎo)的紅細(xì)胞分化[40]??崴峋哂袠O高價(jià)值的化工產(chǎn)品,可作為醫(yī)藥中間體[41],還可用于防治登革熱病毒感染。因此,推測(cè)遼粳433具有成為高食味、高膳食纖維和保健功能大米的潛力。
表2 遼粳433與越光糙米之間差異代謝途徑和參與的代謝物Table 2. Different metabolic pathways and involved metabolites between brown rice of Liaojing 433 and Koshihikari.
本研究檢測(cè)到的參與肌醇磷酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、酪氨酸代謝和苯丙烷生物合成的代謝產(chǎn)物相對(duì)含量均表現(xiàn)為遼粳433高于越光,可以推測(cè),與越光相比,遼粳433糙米中這5個(gè)代謝通路更加活躍。植物體中約1/5的次生代謝產(chǎn)物是由苯丙烷類衍生物代謝途徑產(chǎn)生的[42],光合作用固定的碳約有20%被導(dǎo)入苯丙烷途徑[43]。代謝產(chǎn)物分析表明,遼粳433糙米中次生代謝物相對(duì)含量高的種類占次生代謝物總數(shù)的76.67%,是否和苯丙烷代謝途徑有直接關(guān)系有待進(jìn)一步分析。酪氨酸代謝可以提供必需的微量元素如維生素E等[44]。肌醇磷酸代謝與抗壞血酸和醛酸代謝緊密相連,抗壞血酸具有治療壞血病、預(yù)防癌癥、防治貧血、增強(qiáng)人體免疫力等功效[45],在植物體內(nèi)抗壞血酸合成代謝途徑有4條,其中肌醇代謝途徑可作為補(bǔ)充途徑[46],肌醇是肌醇6-磷酸的合成前體。磷酸肌醇的代謝可能與多個(gè)生理過程相關(guān),肌醇6-磷酸是禾谷類作物種子中磷的主要存儲(chǔ)方式[47],是生物體內(nèi)重要的信使分子,也具有明顯的抗癌能力[48]。這些代謝途徑中間產(chǎn)物絕大部分具有正面營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
大米和人類生活息息相關(guān)。了解每一個(gè)品種的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值為居民的選擇提供方便。越光在日本乃至世界具有盛名,我們研究結(jié)果表明,遼粳433糙米中的不飽和脂肪酸、膳食纖維,GABA、α-生育酚、泛酸、奎尼酸等含量高于越光,影響了遼粳433的風(fēng)味、總體營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和抗氧化活性?;?GC-MS方法進(jìn)行大米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)可以為優(yōu)質(zhì)水稻品種選育及最終商業(yè)化的水稻品種提供理論依據(jù)。