基于微衛(wèi)星標記的長江江蘇段鰱(Hypophthalmichthys molitrix)增殖放流資源貢獻率的評估*

楊習文，劉 熠，薛向平，王邢艷，文 紅，王小豪，徐東坡，周彥鋒，方弟安

(1:上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

(2:中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心農業(yè)農村部淡水漁業(yè)與種質資源利用重點實驗室，無錫 214081)

(3:南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，無錫 214081)

近年來，由于國家對長江資源保護力度加強，以“四大家魚”為主的人工增殖放流使得漁業(yè)資源下降問題得到緩解. 增殖放流是指將人工繁育苗種或采集到的野生苗種投放到自然水域中，突破自然種群的更新限制(recruitment limitation)，修復受損水域生態(tài)系統(tǒng)中的生物資源，提高漁業(yè)資源產量[1]. 科學的增殖放流活動是有效的生態(tài)補償措施，在維持水域生態(tài)系統(tǒng)平衡、促進水生生物資源恢復[2]、實現(xiàn)可持續(xù)的漁業(yè)生產[3]和減緩水利工程對魚類的負面影響[4]等方面有重要作用.

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)是我國“四大家魚”之一[5]，廣泛分布于我國各大水系和湖泊[6]. 長江鰱增殖放流活動已開展多年，放流規(guī)模越來越大，但有關鰱增殖放流資源貢獻率評估的研究較少. 李小芳[7]對2010年和2011年湖北江段放流親魚的遺傳效果進行評估，并確定2年對卵苗發(fā)生量的貢獻率分別為1.33%、6.78%；王軍紅等[8]對2010-2012年長江三峽大壩至葛洲壩江段經濟魚類(鰱為主要放流和標記物種)增殖放流進行評價，確定3年回捕率分別為0.0465%、0、0.0114%. 自此以后，很少有學者對鰱增殖放流資源貢獻率展開針對性的研究. 目前，評估增殖放流資源貢獻率的主要方法有基于生物學統(tǒng)計數據的“放流效果統(tǒng)計量評估法”[9]和“標記放流回捕技術”[10-14]. 微衛(wèi)星標記(microsatellite markers)作為多態(tài)性高的分子標記，被廣泛應用于動物的親緣和家系鑒定、群體遺傳信息研究和遺傳育種等方面[15-17]. 成熟的微衛(wèi)星標記技術已適用于水生生物增殖放流資源貢獻率評估和魚類洄游路線研究[18-19].

鰱作為長江下游增殖放流的主要放流物種，對其增殖放流資源貢獻率的評估具有代表性，一定程度上能反映放流物種整體的資源貢獻率. 本研究利用SSR熒光標記技術，標記8個主要原良種場(為江蘇省各地政府放流工作提供苗種的單位)鰱親本群體，結合親子鑒定技術，評估2016-2017年增殖放流對長江江蘇段鰱資源的貢獻率. 本次研究首次對長江下游大規(guī)模放流物種鰱資源貢獻率進行評估，研究結果將為今后的增殖放流評估工作提供重要的參考依據.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016-2018年，共采集鰱鰭條樣品1096尾. 其中，2016年3月至2017年12月，采集江蘇省8個原良種場鰱親本鰭條621尾，見表1. 2016-2017年，8個原良種場孵化的鰱幼苗陸續(xù)被放流到長江下游的9個江段(南京、鎮(zhèn)江、揚州、揚州、泰州、靖江、江陰、張家港、如皋，位于江蘇省)，放流情況見表2. 放流3個月后，在1年的時間里從長江下游4個江段(鎮(zhèn)江、靖江、張家港、常熟，距離其他省份較遠，可避免其他省份增殖放流影響)陸續(xù)捕撈475尾鰱. 非致命取樣剪取活魚的尾鰭，無水乙醇(江蘇聯(lián)海生物科技有限公司)保存，采樣和放流位點見圖1.

1.2 DNA提取與PCR反應

采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物技術有限公司)提取鰭條組織基因組DNA. 提取的基因組DNA按照常規(guī)方法檢測其質量，提取成功后，置于-20℃下保存.

11對熒光微衛(wèi)星引物選取參照譚照君等[20]，由上海睿迪生物科技有限公司合成，見表3.

10 μL PCR反應體系：5 μL Premix Taq (Takara Taq Version 2.0 plus dye)(Takara，寶生物工程有限公司)，0.2 μL上下游引物稀釋液，1 μL DNA稀釋液，3.8 μL去離子水.

PCR反應程序設定：94℃預變性120 s；94℃變性20 s，-59℃退火20 s；72℃延伸20 s；72℃延伸600 s；4℃保存，反應循環(huán)30次.

表1 8個原良種場和4個長江江段鰱采樣數量

表2 長江江蘇段主要的9個放流地點鰱放流數量

圖1 原良種場、長江采樣位點(a)和主要放流位點(b)

采用聚丙酰胺凝膠電泳法(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)檢測PCR產物，凝膠濃度為8%，取2.5 μL PCR產物，采用2.5 μL DNA Step Ladder，25～300 bp(Takara,寶生物工程有限公司)作為參照，垂直電泳條件為250 V，150 mA，電泳2.5 h，銀染后置于GBOX F3型凝膠成像分析系統(tǒng)(基因有限公司)上拍照. 將剩余PCR產品，每3種不同熒光類型引物的擴增產物各取4 μL混合，送上海睿迪生物科技有限公司進行高效毛細電泳檢測(High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE).

表3 鰱的11對微衛(wèi)星熒光引物參數

1.3 數據分析

使用親緣關系分析軟件Cervus 3.0.7[21]對621尾鰱親本群體和475尾鰱回捕群體進行親子關系分配. 首先，應用軟件采用基于Yates校正的Hardy-Weinberg平衡檢測，當df= 1或Bonferroni校正時，計算微衛(wèi)星座位的多態(tài)性參數(等位基因頻率、觀測雜合度和期望雜合度等)，同時估計每個座位的非親權排除率(non-exclusion probability,NEP). 其次，進行模擬親子分析：100000個重復周期，475個后代，621個未知性別的父母本，100%的候選親本抽樣和1%的默認分型錯誤率，應用LOD值(總似然比的自然對數)計算置信度[21]，設置95%的嚴格置信和80%的寬松置信水平. 最后，通過親子鑒定將原良種場親本產生的放流子代篩選出來，并計算回捕率(即放流子代數量與總捕撈數量的比值).

2 結果與分析

2.1 微衛(wèi)星座位的多態(tài)性參數

Cervus 3.0.7顯示，11個微衛(wèi)星座位共檢測出191種等位基因，每個座位的等位基因種類數范圍為9～36，平均值為17.36，種類數最少的座位是HLJBL203，種類數最多的座位是HLJBL217. 每個座位的觀測雜合度范圍為0.536～0.793，平均值為0.656；每個座位的期望雜合度范圍為0.597～0.941，平均值為0.794. 11個座位均表現(xiàn)出高度的多態(tài)性，每個座位的多態(tài)信息含量范圍為0.560～0.938，平均值為0.771. Hardy-Weinberg平衡檢測顯示，所有的11個座位表現(xiàn)出不同程度地偏離Hardy-Weinberg平衡，有5個座位表現(xiàn)出極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡. 微衛(wèi)星座位多態(tài)性參數見表4.

表4 微衛(wèi)星座位多態(tài)性參數

2.2 鰱增殖放流資源貢獻率

Cervus 3.0.7結果表明，在親本性別未知的情況下，非親排除率(NEP)范圍為2.4%～42.4%；累積非親權排除率(combined non-exclusion probability,CEP)在第3個座位時達到95%以上(即95.5789%)；在第10座位是達到99.9999%以上(即99.9999994%)，見表5.

表5 鰱親子鑒定非親權排除率(NEP)和累積非親權排除率(CEP)

在95%置信度、LOD>0條件下，基于較高的座位累積非親權排除率，621尾原良種場親本群體和475尾捕撈鰱群體中，39尾鰱個體確認為原良種場親本群體產生的子代. 其中，鎮(zhèn)江江段16尾，靖江江段8尾，常熟江段6尾、張家港江段9尾；對應的親本群體，揚州市邗江長江系家魚原種場7尾，泰興市曲霞國平漁業(yè)合作社5尾，泰興水產良種場4尾，皇塘水產養(yǎng)殖場0尾，句容良種場1尾，未來良種場8尾，昆山良種場4尾，南通市如皋水產良種場9尾，親子鑒定結果見表6. 因此，原良種場放流的子代與總捕撈數的比率為8.21%.

表6 長江鰱群體與原良種場親本群體的親子鑒定結果

3 討論

3.1 實驗方案的科學性

以往評估增殖放流資源貢獻率的研究，通常采用物理和化學等方法標記放流個體，存在標記數量較小，難以覆蓋全部家系的放流子代；同時存在人工標記操作流程繁瑣、魚體容易出現(xiàn)死亡、標記容易脫落和留存時間較短等問題，影響標記效果. 本研究采用SSR標記的回捕率為8.21%，遠高于王軍紅等[8]采用傳統(tǒng)方法標記以鰱為主的經濟魚類(3年回捕率分別為0.0465%、0、0.0114%). 因此，采用SSR標記技術標記繁殖親本，實現(xiàn)間接標記采樣親本的所有放流子代，消除了標記數量限制，永久標記放流個體，無人為因素造成的魚體死亡，不受生活史影響，有利于進行長期的動態(tài)監(jiān)測和魚類洄游行為的探究[13].

本研究采用體積較小的10 μL PCR反應體系，不僅能縮短PCR反應時長，避免多重PCR反應的不足，提高PCR實驗效率，而且極大地減少實驗材料的消耗，降低實驗成本. 因此，采用10 μL PCR反應體系具有可行性，適合對大規(guī)模的群體進行親子鑒定.

利用在引物5′端拼接熒光染料的引物進行PCR擴增，結合高效毛細管電泳法檢測，可以有效區(qū)分主峰和偽影，提高基因分型的準確性[22]. 本研究將4種不同的熒光染料應用于11對微衛(wèi)星標記，這些座位都具有高度的多態(tài)性，即PIC>0.5，高度多態(tài)性[23]，可提供豐富的遺傳信息，是作為親子鑒定的有效遺傳標記. 本研究在第3個座位時累積排除率在95%以上(即95.5789%)，累積排除率已經滿足親子鑒定最低標準[24]，同時，本研究實際正確匹配座位數在10個位點以上，而微衛(wèi)星標記的鑒別能力高，出現(xiàn)1～2個座位錯配不影響得出正確結果[25]，因此親子鑒定結果可靠. 在親子鑒定中，累積排除率(CEP)越高，親子鑒定準確率就越高[26]，本研究中的11對微衛(wèi)星座位累積非親權排除率在99.99%以上，鑒定準確率較高，高于李小芳[7]研究結果(14個微衛(wèi)星座位，99.91%)，與成為為等[27](11對微衛(wèi)星座位，放流胭脂魚(Myxocyprinusasiaticuss)親本，99.9983%)、劉海映等[28](10個微衛(wèi)星座位，放流三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)子代，99.99%以上)等的研究結果相似.

為評估大規(guī)模的增殖放流效果，我們建立了“標記親本-放流與再捕撈-親子鑒定”的系統(tǒng)評估方法，以評估資源貢獻率. 第一，收集原良種場親本鰭條樣品(所有雌雄個體)，包括用于供給增殖放流苗種的當年人工繁殖親本、良種場培育池后備親本和新引進的長江鰱，選用高度多態(tài)的微衛(wèi)星座位，建立鰱親本基因庫. 第二，被標記的親本繁殖后，其子代經培育后放流至長江. 第三，3個月之后，在放流區(qū)域定期定點(干流和附屬河流、湖泊)進行捕撈，采集鰱DNA樣品. 第四，通過DNA提取、PCR反應、基因分型和親子鑒定，確定親本的子代數量，計算資源貢獻率. 此外，這種“標記親本-放流與再捕撈-親子鑒定”的系統(tǒng)評估方法同樣適用于其他魚類增殖放流效果資源貢獻率的評估.

3.2 資源貢獻率的影響因素

在長江，鰱洄游習性(江河洄游性魚類)可能影響貢獻率的評估. 每年夏天，性成熟鰱從長江的附屬河流或湖泊游到長江干流水流湍急處產卵；受精卵孵化后，部分幼魚在長江干流沿岸淺水處生長，大部分幼魚隨洪水漂流或游到附屬河流和餌料豐富的湖泊中覓食生長，或在發(fā)育成稚魚后游到附屬水域，在3～5年內達到性成熟[29]. 同理，大量的原良種場孵化的鰱幼魚被放流后進入附屬河流或湖泊，而長江水域面積廣闊，本研究在長江干流漁業(yè)捕撈水域設置4個采樣點(采樣點偏少)，可能導致收集到的樣品中放流鰱數量占比偏少. 同時，由于采樣時間的限制，原良種場仍然有部分親本群體遺傳信息未能采集，使得未被標記的放流子代無法鑒定出來. 由此可見，長江江蘇段鰱增殖放流的實際資源貢獻率可能超過8.21%.

放流物種的規(guī)格差異和漁業(yè)捕撈也可能影響魚類增殖放流資源貢獻率. 湖北省將479尾(2010年)和1144尾(2011年)親本鰱分別放流到長江監(jiān)利段，李小芳[7]利用SSR標記進行親子鑒定，確定放流鰱親本對2010年魚苗資源貢獻率為1.33%，對2011年魚苗資源貢獻率為6.78%. 本研究放流魚苗對資源量的貢獻率達到8.21%，比起放流鰱親本要高，可能受到放流規(guī)格差異、漁業(yè)捕撈的選擇以及禁漁期難以覆蓋整個繁殖期(鰱3～7月[30])等因素影響，使得放流的成魚被捕獲概率比魚卵、仔稚魚或幼魚更高. 另外，課題組在走訪漁業(yè)作業(yè)現(xiàn)場時發(fā)現(xiàn)，漁獲物中超過法律標準的成年魚類(禁捕規(guī)格：如鰱，5 kg以上、65 cm以上；青魚(Mylopharyngodonpiceus)，13～15 kg以上、90 cm以上[31])幾乎沒有被放歸長江. 考慮到較大的漁業(yè)捕撈強度以及長江產卵場惡化的生境，很可能存在放流的親魚“一次性產卵”或未產卵的情況，而育苗場環(huán)境惡化又會降低孵化率和存活率，使得放流的親本繁殖和育苗成效低于原良種場人工繁育效果，增殖放流效果不佳. 較為成功的放流案例為我國二級保護動物胭脂魚(等同于全年禁捕)，漁政部門在長江武漢至宜賓江段放流胭脂魚幼苗，其回捕率高達16.92%[27]，高于一些經濟魚類的回捕率(例如，草魚(Ctenopharyngodonidellus)為6.395%～14.316%[32]). 由此可見，漁業(yè)捕撈對增殖放流效果有一定負面影響，較長的禁漁期可以極大地提高增殖放流的資源貢獻率.

此外，野生魚類和人工養(yǎng)殖魚類在放流后的擴散差異會影響回捕率. 例如，野生的香魚(Plecoglossusaltivelis)與人工養(yǎng)殖的香魚在河流的擴散模式也存在顯著差異(野生的香魚向上游游動，人工養(yǎng)殖的香魚向下游游動)，并且捕獲率也保持差異[33].

3.3 增殖放流效果“量”和“質”的評估

本研究表明2016-2017年鰱增殖放流活動對長江江蘇段鰱資源量有較大的補充. 本研究存在采樣時間跨度較短、采樣點設置不夠密集、采樣頻次較少和非全部放流子代的親魚被采樣等情況，研究結果大致反映了鰱增殖放流的資源貢獻率，但無法監(jiān)測增殖放流鰱群體在長江水體的種群變化趨勢和擴散路線. 在后續(xù)的研究中，我們將在長江干流和附屬河流設置更密集的采樣點，增加采樣頻次和時間跨度，完善親本微衛(wèi)星基因庫，提高資源貢獻率評估的準確性，實現(xiàn)對放流群體長期的動態(tài)監(jiān)測.

歷史上的鰱捕撈量巨大，說明歷史上的鰱環(huán)境容量很大，增殖放流數量還有很大的提升空間. 由于長江水域環(huán)境的惡化，環(huán)境承載力可能發(fā)生改變，而某一物種數量的增加，也會影響生態(tài)系統(tǒng)中該物種的捕食者、被捕食者的生物量(正效應和負效應)，增強與該物種有相同食物來源生物間的競爭關系[34]. 放流適量的鰱和鳙可以控制浮游植物的數量，減少水華暴發(fā)的風險，提高初級生產力向次級消費者能量傳遞效率[35]，但如果放流量過多，也有可能導致部分放流鰱因食物短缺而死亡. 因此，設定合理的增殖容量不僅能提高放流物種存活率，而且可以降低對水域生態(tài)系統(tǒng)的風險[36]，減少放流的資金浪費. 林群等[37]通過構建黃河口鄰近海域不同月份的Ecopath模型，初步評估了三疣梭子蟹的增殖生態(tài)容量，為漁業(yè)資源增殖養(yǎng)護長遠發(fā)展提供了指導性建議；楊超杰等[38]基于Ecopath模型估算萊州灣朱旺人工魚礁區(qū)刺參(Apostichopusjaponicus)的增殖生態(tài)容量，并提出了階段性的增殖管理策略. 同時，實際的增殖放流活動往往同時放流多種水生生物，涉及多個不同營養(yǎng)級生物量的變動，勢必會影響生態(tài)系統(tǒng)的能量轉換率和穩(wěn)定性，而目前增殖生態(tài)容量的研究多集中于評估某一生態(tài)系統(tǒng)下單一放流物種的增殖容量，很少涉及某一生態(tài)系統(tǒng)下組合分析多個放流物種的增殖容量配置. 因此，在后續(xù)的研究中，我們將在評估放流增殖鰱資源貢獻率基礎的同時，對放流水域的資源和生態(tài)進行調查，構建Ecopath模型，對比放流前后生態(tài)系統(tǒng)各功能組的變化，推算鰱以及其他放流物種的增殖容量配置，實現(xiàn)增殖放流“量”的評估.

以往研究發(fā)現(xiàn)，增殖放流存在一定的遺傳風險(genetic risk)，如增加群體基因流，降低群體有效群體大小(effective population size)，促進遺傳同質性(genetic homogeneity)等[39-40]. 朱曉東等[41]利用30個微衛(wèi)星標記，研究了長江中下游5個野生鰱群體，發(fā)現(xiàn)有10個以上基因座表現(xiàn)出極顯著偏離的Hardy-Weinberg平衡；李小芳[7]發(fā)現(xiàn)放流鰱親本后，所采集的鰱群體間呈現(xiàn)較低的遺傳分化程度和較近的遺傳距離；張敏瑩等[42]發(fā)現(xiàn)長江下游4個放流群體呈現(xiàn)出一定的近交現(xiàn)象和群體間較低的遺傳分化程度. 雖然，上述研究反映出長江鰱群體遺傳多樣性特征可能因增殖放流發(fā)生了變化，但由于上述研究采用較為傳統(tǒng)實驗技術，或研究年代距今較為久遠，未能證實鰱增殖放流已經造成了負面的遺傳效果. 同時，本研究主要集中于利用微衛(wèi)星親子鑒定技術評估增殖放流資源貢獻率，未對各群體遺傳多樣性進行分析，且缺乏增殖放流前江蘇段鰱群體的遺傳多樣性本底調查，無法評估可能存在的遺傳風險. 因此，在今后的研究中，我們將結合本次研究中的群體遺傳數據，繼續(xù)利用SSR熒光標記技術對鰱增殖放流后的群體遺傳特征進行跟蹤調查，探究鰱增殖放流已造成負面的遺傳效果，提出有針對性的增殖放流優(yōu)化方案，減少遺傳風險，以實現(xiàn)增殖放流“質”的評估.

4 小結

2016-2017年，長江江蘇段增殖放流對鰱在江群體的資源貢獻率在8.21%以上. 本研究是首次對長江下游大規(guī)模放流物種鰱(增殖放流活動中放流數量占比最大的物種)進行資源貢獻率評估，一定程度上反映了放流物種整體的資源貢獻率. 本研究所采用的實驗方法和技術，將對今后鰱及其他物種的增殖放流貢獻率評估有重要參考價值，所得出的結論將為以后的增殖放流工作提供科學依據.

致謝：感謝中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心李建林副研究員在實驗和數據分析等方面給予的指導和幫助. 感謝本研究中所涉及的原良種場的工作人員和漁民在樣品采集和戶外作業(yè)提供的便利和幫助.