棉花GhERF14基因在擬南芥中的功能驗證

趙龍飛 袁玥 明聰

摘 ? 要：隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，在模式植物擬南芥中初步探索分析基因功能的方法日漸成熟。為了探索棉花GhERF14基因的功能，構(gòu)建過表達載體，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入擬南芥中，通過篩選純化獲得純合體轉(zhuǎn)基因植株，觀察表型，發(fā)現(xiàn)GhERF14基因?qū)M南芥的生長狀況有一定的抑制作用，初步分析基因的功能為后續(xù)研究奠定一定的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：擬南芥;GhERF14基因;功能驗證

1 ? 材料

野生型、擬南芥大腸桿菌感受態(tài)DH5α、農(nóng)桿菌菌株GV3101，植物過表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS（含KnptⅡ基因）由本實驗室保存。

2 ? 試驗方法

2.1 ? 擬南芥pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14過表達載體的構(gòu)建

過表達載體在試驗前期已經(jīng)構(gòu)建好的目的基因與帶有35S的過表達載體連接即可，方法可參照目的基因與PMD19-T的連接方法。

2.2 ? 電擊法轉(zhuǎn)化pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF

14重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌GV3101

將驗證好的質(zhì)粒利用電擊的方法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

2.3 ? 擬南芥侵染液配制

將含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌新鮮菌液1‰加入含有50 mg/L的Kan、50 mg/L的Rif的新鮮滅菌LB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、200 rpm的恒溫搖床30～36 h，直至菌液呈橘黃色，菌液OD600值為0.6左右為止。緩沖液配置500 mL體系：MS Medium 1.185 g、蔗糖25 g、Swillter-77 150μL、乙酰丁香酮（AS）500μL。4 ℃，5 000 g離心沉淀搖好的菌液，棄上清，用配制好的緩沖液在冰上懸浮，直至OD600值為0.5左右為止[1]。

2.4 ? 擬南芥的侵染

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，取已經(jīng)盛開的擬南芥植株，用剪刀去除果莢和花敗的花，將花蕾浸泡于已經(jīng)配制好的侵染液中，花蕾充分接觸侵染液，時間不超過1 min，對侵染結(jié)束的植株進行遮光處理24 h，溫度為23 ℃。每間隔5～7 d侵染1次，直至擬南芥生育期結(jié)束，收取擬南芥T0代種子，去除雜質(zhì)，放于37 ℃恒溫烘箱中24 h后進行篩選鑒定。

2.5 ? 擬南芥DNA的提取以及PCR檢驗

取適量的新鮮擬南芥葉片，利用無菌研缽在液氮中研磨，然后根據(jù)Magen公司生產(chǎn)的植物DNA提取試劑盒的說明書進行，對提取的擬南芥DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，對DNA質(zhì)量好的模板進行PCR檢驗[2]。

2.6 ? 轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長狀況調(diào)查

將轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型擬南芥在溫度、光照、濕度相同的生長環(huán)境下進行培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株在苗期、抽薹期、成熟期的生長狀況。

3 ? 結(jié)果與分析

3.1 ? 擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化及陽性植株篩選

將驗證正確的含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14的農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，對T0代種子進行50 mg/L濃度的Kan檢驗收取陽性植株，對T1、T2、T3植株單株收取種子，并對T1代植株葉片提取DNA，進行PCR凝膠電泳檢測[3]。

3.2 ? 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株表觀形態(tài)

在T1代分別選擇2個株系進行單株收種，然后分別在相同的環(huán)境下種植并進行篩選純化，分別以T2-1、T2-2作為標(biāo)記。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與野生型相比苗期生長較慢，生育期延后當(dāng)野生型抽薹后，T2-1、T2-2才剛剛長滿葉，通過對比T2-1、T2-2發(fā)現(xiàn)：T2-1相比T2-2長勢更弱、更慢。推斷這可能與農(nóng)桿菌侵染的染色體的部位不同部分有關(guān)，T2-1植株長勢最慢，可能是A、D染色體同時被侵染，雙供體侵染，具體原因還有待進一步探究。可以看出該基因可能與植株的生長發(fā)育有一定的關(guān)系。

當(dāng)轉(zhuǎn)基因株系開始抽薹時，野生型株系已經(jīng)接近成熟，野生型株系比轉(zhuǎn)基因T2-2提前15 d。對比T2-1、T2-2株系，T2-2株系明顯比T2-1生長得快，當(dāng)T2-2株系抽薹后4 d，T2-1才剛剛開始抽薹?？梢钥闯?，棉花GhERF14不僅影響棉花的生長，甚至?xí)七t生育期[4]。

轉(zhuǎn)基因擬南芥盛花結(jié)莢時與野生型相比，其生育期晚了15～20 d。當(dāng)轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系都接近成熟時，野生型的株高和植株分枝情況都大于轉(zhuǎn)基因株系。同時轉(zhuǎn)基因株系T2-1與T2-2相比也比較弱，分枝更少，T2-1長勢更弱，分枝少，說明棉花GhERF14嚴重影響了植株的生長發(fā)育和分枝狀況。

4 ? 討論與小結(jié)

通過觀察轉(zhuǎn)基因植株與野生型生長狀況和生長勢的差別發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株長勢比較弱，生育期延后。植物抗病防御反應(yīng)的調(diào)控是非常復(fù)雜的，有許多轉(zhuǎn)錄因子家族扮演著重要的角色，對后續(xù)試驗有一定的借鑒意義。

通過該試驗發(fā)現(xiàn)，該基因不僅可以調(diào)控植株對枯萎病菌的抗性，還具有調(diào)控植株生長發(fā)育的作用，但是針對擬南芥中是否對枯萎病有響應(yīng)還有待探究，為該基因在生物學(xué)功能方面的研究奠定了基礎(chǔ)，有利于下一步試驗的開展，對后續(xù)試驗有一定的借鑒意義。

參考文獻：

[ 1 ] Concatenate Luis，Anderson Jonathan P，Young Jodi，et al.AtERF14，a member of the ERF family of transcription factors，plays a nonredundant role in plant defense[J].Plant Physio-logy，2006，143（1）.

[ 2 ] 趙曾強.棉花GhWRKY44和GhWRKY22基因的克隆及功能初步分析[D].石河子：石河子大學(xué)， 2015.

[ 3 ] Singh K， Foley R C， Oate-Sánchez L. Transcription factorsin plant defense and stress responses[J].Curr.opin.plant Biol，2002，5（5）：430.

[ 4 ] Rushton P J，Somssich I E.Transcriptional control of plantgenes responsive to pathogens[J].Current Opinion in PlantBiology，1998，1（4）：311.