HPLC法測定石龍清血顆粒中莫諾苷和馬錢苷的含量

齊喜紅，高 萌，李 昕，張?zhí)J燕，王 慶

石龍清血顆粒全方由山茱萸、鉤藤等十四味藥組成，具有滋陰潛陽、平肝熄風(fēng)、化瘀止血的功效，用于肝陽化風(fēng)、腦脈瘀阻所致中風(fēng)等癥狀。山茱萸為處方中的主要藥味，具有抗菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降血糖等作用。目前認(rèn)為其主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷，而莫諾苷和馬錢苷均屬于此類成分[1-2]。但因產(chǎn)區(qū)不同其化學(xué)成分差異較大，河南南陽與山西陽城產(chǎn)的山茱萸馬錢苷含量高，山西陽城與浙江杭州產(chǎn)的山茱萸莫諾苷含量高[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-7]，研究建立了HPLC法同時(shí)測定二者含量，為石龍清血顆粒中山茱萸的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 資料與方法

1.1 一般資料：Agilent 1260型的高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器，Elma超聲清洗儀，梅特勒XS205電子天平。

1.2 材料：莫諾苷對照品(批號：111998-201501)、馬錢苷對照品(批號：111640-201005)均購于中國食品藥品檢定研究院。試劑乙腈為色譜純，水為高純水，甲醇和乙醇為分析純。5批石龍清血顆粒樣品為吉林省健今藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(批號分別為：20120301、20120302、20120303、20140708、20141103)。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液制備：取莫諾苷和馬錢苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1 mL含莫諾苷和馬錢苷分別為26.4、28.7 μg的混合溶液，即得。

1.3.2 供試品溶液制備：取本品，研細(xì)，取約1g，精密稱定，精密加入50%甲醇溶液25mL，密塞，稱重。超聲(250 W， 40 Hz)提取35 min，放至室溫，再稱重后用50%的甲醇補(bǔ)重。搖勻后用0.45 μm的濾膜濾過，取用續(xù)濾液，即得。

1.3.3 陰性溶液制備：參照石龍清血顆粒的處方組成，制得缺山茱萸陰性供試品，以“2.2”項(xiàng)下方法，制備陰性樣品溶液。

1.3.4 色譜條件：色譜柱為Phenomenex Gemini C18 110A(250 mm×4.6 mm， 5μm)，以乙腈為流動相A，以0.3%磷酸溶液為流動相B；按表1進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長240 nm，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果：取對照品溶液、樣品溶液及陰性溶液，以“2.4”項(xiàng)的色譜條件測試，結(jié)果表明樣品色譜圖中，在與莫諾苷和馬錢苷對照品色譜相應(yīng)的保留時(shí)間有相同色譜峰，而陰性樣品溶液在相應(yīng)保留時(shí)間處無干擾。

2.2 線性關(guān)系考察：精密吸取對照品混合溶液(每1 mL含莫諾苷15.51 μg，馬錢苷17.56 μg)0.4、1、2、3、4 mL至10 mL棕色容量瓶中，滴加甲醇至刻度，搖勻。按“2.4”項(xiàng)下的方法進(jìn)行測定。以濃度(X)作為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)作為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸?；貧w方程與相關(guān)系數(shù)為：Y=1 639X-8.235(r=0.999 9)、Y=1 446.7X+0.373 4(r=1.000 0)。結(jié)果表明莫諾苷在0.062～0.776 μg、馬錢苷在0.07～0.878 μg范圍內(nèi)具有較好線性關(guān)系。

2.3 精密度考察:吸取混合對照溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果顯示，莫諾苷、馬錢苷峰面積的RSD分別為0.67%和0.41%，說明儀器的精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品6份，以“2.2”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，進(jìn)行測定。測得莫諾苷和馬錢苷的平均含量分別為0.58、0.50 mg/g，RSD為1.30%和1.66%，表明此法重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性考察：取同一樣品溶液，每隔2 h 進(jìn)樣1次，連續(xù)進(jìn)樣10次。結(jié)果莫諾苷和馬錢苷峰面積的RSD分別為0.88%和0.59%，表明樣品中莫諾苷和馬錢苷在18 h 內(nèi)較穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取已知含量的石龍清血顆粒樣品0.5 g，精密稱定6份，分別精密加入混合對照品溶液(莫諾苷12.04 mg/L、馬錢苷11.39 mg/L)25 mL，按“2.2”項(xiàng)下的方法制取供試品溶液，進(jìn)行測定。計(jì)算2個(gè)成分的加樣回收率，測得結(jié)果見表2。

表2 石龍清血顆粒中2種成分的準(zhǔn)確度試驗(yàn)

2.7 樣品含量測定：取5批石龍清血顆粒樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定，見表3。

表3 石龍清血顆粒中各成分的含量測定

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

3.1.1 檢測波長的選擇：通過二極管陣列檢測器進(jìn)行全波長掃描(190～400 nm)，莫諾苷和馬錢苷的最大吸收波長分別為240 nm和236 nm，結(jié)合現(xiàn)版藥典[8]，本次試驗(yàn)最終選用240 nm作為測定波長。

3.1.2 流動相的選擇：采用甲醇-水梯度洗脫，乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫及乙腈-0.1%甲酸溶液進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)合高效液相色譜圖，最終確定本文的流動相系統(tǒng)。

3.2 樣品提取條件的優(yōu)化：本實(shí)驗(yàn)對比了加熱回流提取法和超聲提取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方法提取率相近，考慮超聲簡便快捷，故實(shí)驗(yàn)選擇超聲提取法。同時(shí)考察了不同濃度的甲醇提取液，最終選用了50%的甲醇溶液作為本次試驗(yàn)的提取溶劑。

本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法測定石龍清血顆粒中山茱萸的含量，該方法具有操作簡便，分離度和重現(xiàn)性良好，專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，能有效控制石龍清血顆粒中山茱萸的質(zhì)量。