銅摻雜二氧化硅用于雪菊中木犀草苷的富集及近紅外光譜分析

楚剛輝, 姜盼盼

(喀什大學 新疆特色藥食用植物資源化學實驗室, 化學與環(huán)境科學學院, 新疆 喀什 844006)

雪菊是新疆和田、 喀什等地區(qū)的一種特色花茶, 具有降血壓、 降血糖、 降血脂和抗氧化等功效[1-6], 在新疆多地區(qū)已實現(xiàn)規(guī)?；N植[7]. 黃酮和其他多酚類物質是雪菊的主要有效成分[8-9], 木犀草苷是雪菊中的一種黃酮類物質, 由木犀草素結合一個單糖組成. 木犀草苷的鄰二酚羥基特殊結構使其具有抗氧化、 抗腫瘤、 抗感染和解熱抗炎等藥理活性[10]. 目前, 植物中木犀草苷的常見分析方法有高效液相色譜法[11-12]、 高效液相色譜-質譜聯(lián)用法[13-14]、 二維液相色譜法[15]和超臨界色譜法[16]等, 這些方法具有良好的選擇性, 但操作繁瑣、 有機溶劑消耗多且測定時間長. 近紅外光譜(NIR)是介于可見與中紅外光間的一種電磁輻射光譜, 主要反映有機分子中含氫基團(O—H,N—H,C—H等)振動的倍頻和合頻的吸收光譜信息. NIR分析測定技術具有無損、 快速、 易實現(xiàn)在線檢測等優(yōu)勢, 可用于農業(yè)、 煙草和制藥等行業(yè)產品的質量標準控制[17-18]. 近紅外光譜檢測限高, 可用于質量分數(shù)大于0.1%的組分分析. 為實現(xiàn)近紅外光譜的靈敏性檢測, 以富集技術與近紅外光譜結合進行樣品中微量成分的檢測研究已引起人們廣泛關注[19-21], 如在一定條件下, 木犀草素的鄰二酚羥基結構可與某些金屬離子配合[22-23]. 木犀草苷是木犀草素結合一個單糖的糖苷類物質， 也可通過其鄰二酚羥基結構與金屬的配合作用富集樣品中的木犀草苷. 本文以新疆巴楚產的雪菊為測試樣品, 用制備的銅摻雜二氧化硅作為吸附劑對雪菊所含的微量木犀草苷進行富集, 并通過近紅外漫反射光譜結合化學計量學方法實現(xiàn)對微量木犀草苷靈敏、 選擇性地檢測.

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

AntarisⅡ型近紅外光譜儀(美國Thermo公司)； 電子天平(美國梅特勒-托利多儀器有限公司)； 電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)； 超聲波清洗器(寧波新藝超聲設備有限公司)； TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)； SF-TDL-2SOA型低速離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)； HY-2型多用調速振蕩器, JJ-2型增力電動攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠).

正硅酸乙酯(體積分數(shù)為98%)， 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES, 體積分數(shù)為98%)， 木犀草苷(上海晶純生化科技股份有限公司, 質量分數(shù)為98%)； 乙醇、 CuSO4和NaOH均為國產分析純試劑； 新疆巴楚產的雪菊, 粉碎機粉碎, 備用.

1.2 方 法

1.2.1 銅摻雜二氧化硅吸附劑的制備 參照同步水解方法[24]制備吸附劑： 將100 mL乙醇加入500 mL三頸燒瓶中, 置于35 ℃水浴中加熱, 先加入4.0 mL的APTES, 并將100 mL的2 mol/L CuSO4水溶液和20 mL的正硅酸乙酯攪拌1 h, 再加入w(NaOH)=1%的水溶液20 mL, 滴加結束后, 繼續(xù)攪拌反應12 h. 在反應過程中溶液逐漸變藍, 形成藍色乳狀液. 最后, 通過離心分離收集產物, 先用純凈水洗滌至中性, 再用無水乙醇洗滌一次, 收集產物自然晾干后研細, 備用. 銅摻雜二氧化硅吸附劑合成機理如圖1所示.

圖1 銅摻雜二氧化硅吸附劑合成機理

1.2.2 木犀草苷吸附實驗 用銅摻雜二氧化硅吸附劑對木犀草苷進行吸附實驗. 在100 mL錐形瓶中先加入0.25 g吸附劑, 再加入50 mL一定質量濃度的木犀草苷或雪菊提取溶液, 在室溫下于振蕩器中振蕩30 min后, 用量筒式過濾器過濾, 在349 nm處測定濾液吸光度. 木犀草苷的吸附率計算公式為

吸附率=[(A0-A)/A0]×100%,

其中,A0和A分別為木犀草苷溶液吸附前后的吸光度.

1.2.3 木犀草苷的HPLC分析方法 用高效液相色譜(HPLC)法測定雪菊提取液中木犀草苷的含量, 以方便精確配制系列雪菊測試溶液. 色譜條件： Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱, 以乙腈(A)和φ(醋酸)=0.2溶液(B)為流動相, 用梯度洗脫的方式： 0 (φ(A)=15%), 0～40 min(φ(A)=15%～90%) ； 流速為1 mL/min； 色譜柱為常溫, 進樣10.0 μL； 檢測波長為349 nm. 配制質量濃度為1.0～300.0 mg/L的木犀草苷標準樣品系列, 分別進樣10.0 μL, 進行色譜分析. 以木犀草苷的色譜峰面積為縱坐標、 質量濃度(mg/L)為橫坐標獲得一元線性回歸方程：

y=84 016x-2×106,R2=0.994 7.

雪菊提取溶液經0.45 μm微孔濾膜過濾后, 注入色譜儀分析. 圖2為雪菊提取液和木犀草苷標準樣品的色譜.

圖2 木犀草苷標準樣品(A)和雪菊提取液(B)的色譜

1.2.4 雪菊提取液的制備與木犀草苷的富集 稱取適量雪菊, 分別置于100 mL錐形瓶中, 加入φ(甲醇)=35%水溶液50 mL, 靜置過夜后, 超聲30 min, 過濾后備用. 按雪菊樣品高效液相色譜的測定結果, 制成一系列質量濃度為1.5～19.5 mg/L的雪菊提取液, 共68組. 稱取0.25 g一系列銅摻雜二氧化硅吸附劑, 分別置于100 mL錐形瓶中, 再分別加入68組雪菊提取液, 每組均為50 mL. 在常溫下振蕩吸附30 min, 抽濾, 將濾渣于陰涼處自然晾干. 根據(jù)木犀草苷吸附劑不需脫附目標物的性質, 用近紅外光譜直接對其進行測定, 獲得68個雪菊固體樣品的近紅外光譜, 其中以16個雪菊樣本(5對重復樣)為預測模型, 進行近紅外光譜分析.

圖3 68個木犀草苷樣品的近紅外光譜

1.2.5 光譜測量方法 用近紅外光譜儀測定68個雪菊固體樣品光譜, 儀器分辨率為4 cm-1, 在4 000～10 000 cm-1近紅外光范圍內進行光譜掃描, 測試前儀器預熱1 h, 儀器測試過程中, 每運行1 h自動實現(xiàn)校正背景. 為提高雪菊固體樣品的測定信噪比并降低誤差, 每次測量均進行64次掃描, 每個樣品重復測量3次, 將3次數(shù)據(jù)的平均值作為光譜數(shù)據(jù). 68個雪菊固體樣品的近紅外疊加光譜如圖3所示. 近紅外光譜自身靈敏度較低, 可通過化學計量學方法與偏最小二乘回歸共同實現(xiàn)定量模型的建立和含量預測, 通過儀器軟件包TQ analyst 9和MATLAB程序實現(xiàn)建模和預測.

2 結果與討論

2.1 銅摻雜二氧化硅的紅外光譜

圖4 氨基二氧化硅和銅摻雜二氧化硅的紅外光譜

分別將氨基二氧化硅和銅摻雜二氧化硅與溴化鉀按質量比為1∶100～1∶200壓片, 在500～4 000 cm-1內進行紅外光譜掃描, 結果如圖4所示. 由圖4可見, 在3 414 cm-1處為氨基的伸縮振動峰, 在1 632,1 541 cm-1處為氨基的彎曲振動峰, 在1 400 cm-1處為亞甲基的彎曲振動峰. 銅摻雜二氧化硅的紅外光譜在3 414 cm-1處的吸收峰消失, 這是由于氨基和銅發(fā)生了配合作用所致； 氨基的兩個彎曲振動峰遷移至1 623,1 512 cm-1處, 這是由于生成銅氨基配合物后形成環(huán)狀結構, 使共軛體系增強, 吸收峰向低波數(shù)區(qū)遷移所致.

2.2 銅摻雜二氧化硅的掃描電鏡照片

用掃描電鏡(SEM)檢測銅摻雜二氧化硅顆粒的表面形態(tài), 圖5(A)和(B)分別為放大2 000,10 000倍的掃描電鏡照片. 由圖5(A)可見, 其表面粗糙, 表明材料表面已結合了硅烷化產物； 由圖5(B)可見, 材料表面有豐富的孔隙, 可供目標物吸附結合.

圖5 銅摻雜二氧化硅的SEM照片

2.3 銅摻雜二氧化硅吸附劑對木犀草苷的吸附

圖6 木犀草苷標準液吸附前后的紫外可見光譜

為考察目標組分木犀草苷在銅摻雜二氧化硅吸附劑上的吸附行為, 準確稱取0.25 g銅摻雜二氧化硅吸附材料, 置于100 mL錐形瓶中, 加入8.0 mg/L木犀草苷水溶液50 mL, 密塞. 于振蕩器中振蕩30 min, 量筒式過濾分離, 測量吸附前后木犀草苷溶液的紫外可見光譜, 結果如圖6所示. 由圖6可見： 木犀草苷的特征吸收波長為349 nm； 與8.0 mg/L的木犀草苷標準溶液的吸收光譜相比, 被銅摻雜二氧化硅吸附材料吸附后的吸收光譜在349 nm處的吸光度明顯減少, 吸附率達89.7%, 可見銅摻雜二氧化硅吸附劑對木犀草苷具有良好的吸附作用. 因此， 推測可能的吸附機理為銅離子與木犀草苷配合[22-23], 吸附機理如圖7所示.

2.4 木犀草苷的近紅外光譜

2.4.1 木犀草苷定量校正模型的建立 用偏最小二乘回歸(PLS)建立木犀草苷的定量模型, 為進一步優(yōu)化該定量模型, 用一階導數(shù)(1st)、 多元散射校正(MSC)、 標準正態(tài)變換(SNV)和小波變換(CWT)等方法進行原始近紅外光譜預處理[25-26]. 用Monte-Carlo交叉驗證(MCCV)法獲得定量模型的因子數(shù), 不同光譜預處理獲得木犀草苷的定量模型和交叉驗證結果列于表1.

圖7 木犀草苷的吸附機理

表1 木犀草苷的PLS定量模型及交叉驗證結果

圖8 木犀草苷的預測質量濃度與參考質量濃度間的關系

由于近紅外光譜中包含目標物木犀草苷的光譜信息及銅摻雜二氧化硅吸附材料與其他被吸附雜質的組分信號, 因此需選擇合適的光譜預處理方法， 以消除背景干擾對定量預測的影響. 用MATLAB程序建立各種光譜預處理和PLS定量模型, 木犀草苷定量模型的預測能力通過相關系數(shù)R、 交叉驗證均方根誤差(RMSECV)和預測殘差值(RPD)3個參數(shù)檢驗, 其中R反映木犀草苷預測的質量濃度與真實質量濃度的相關程度, RMSECV反映預測質量濃度與真實質量濃度間的偏離程度. 當定量模型的RPD>2.5時, 可實現(xiàn)目標物的定量預測, RPD值越大, 其定量結果越準確[27]. 對照無處理方法, 由表1可見： 經1st,SG平滑,CWT,MSC,SNV,MSC+1st,SNV+1st處理后, RPD值變大, 表明光譜預處理可有效改善定量結果； MSC+1st處理后的相關系數(shù)R值最大, RMSECV誤差最小, RPD值最大, 表明該方法可有效提取木犀草苷的定量檢測信息, 且預測最準確. 由于在樣品的近紅外漫反射測量模式中出現(xiàn)散射作用, 使原始光譜中含有大量與目標組分吸收無關的干擾信息, 因此對定量模型的穩(wěn)定性產生影響, MSC可將不同樣品光譜中的散射信息校正到同一水平, 從而提高了所得定量模型的可靠性[28], 1st可提高測定信噪比和預測準確度[29], 由于MSC+1st發(fā)揮了二者的協(xié)同作用, 使預測結果最優(yōu). 因此, 本文用MSC+1st方法對雪菊固體樣品的近紅外光譜進行預處理.

2.4.2 木犀草苷的定量模型驗證 為考察木犀草苷定量模型的實際預測能力, 用16個雪菊預測集樣品(5對重復樣)檢驗建立的偏最小二乘定量模型. 校正集和預測集的光譜測量設備條件、 雪菊樣品制備方法及定量建模方法均相同, 結果如圖8所示, 其中校正集樣品的散點為黑色圈, 預測集樣品的散點為紅色圈, 參考質量濃度以HPLC確定的結果為準. 由圖8可見, 二者相關關系良好. 當模型的因子數(shù)為9時, 測得校正集的相關系數(shù)為0.975 0, 預測RMSECV為0.959 8 mg/L, 木犀草苷預測集樣品的回收率為82.6%～111.4%. 實驗結果表明, 建立的木犀草苷定量校正模型對雪菊預測集樣品的預測效果良好, 在有吸附劑和吸附雜質等背景干擾的情形下, 經多元散射校正-一階導數(shù)(MSC+1st)法對雪菊樣品的近紅外光譜進行預先處理, 可從雪菊樣品的復雜光譜背景中獲取有效的定量檢測信息, 實現(xiàn)準確、 選擇性地測量雪菊提取液中木犀草苷的含量.

綜上所述, 本文以新疆巴楚產的雪菊為測試樣品, 用制備的銅摻雜二氧化硅作為吸附劑, 建立了一種雪菊中木犀草苷的富集和近紅外光譜檢測方法. 結果表明： 當銅摻雜二氧化硅吸附劑用量為0.25 g、 常溫下振蕩吸附30 min時, 對雪菊測試溶液中木犀草苷的吸附率達89.7%； 雪菊測試樣品的近紅外光譜經MSC+1st處理后, 預測結果最好, 當模型的因子數(shù)為9時, 測得校正集的相關系數(shù)為0.975 0, 預測RMSECV為0.959 8 mg/L, 木犀草苷預測集樣品的回收率為82.6%～111.4%. 因此, 通過吸附與富集結合近紅外漫反射光譜可實現(xiàn)準確、 選擇性地測量雪菊提取液中木犀草苷的含量.