氨氮和亞硝酸鹽對單環(huán)刺螠幼體的急性毒性實驗

張賽賽 宋曉陽 尚宏鑫 孫陽 周竹君 楊婷婷 田斌 宋珞珈 陳文博 劉彤

摘?要：在水溫15.1～17.3 ℃，pH 7.88～8.15，鹽度32.17‰～32.28‰，溶解氧6.40～7.40 mg/L的條件下，采用半靜水法研究了氨氮和亞硝酸鹽對體質(zhì)量（2.86±0.43）g的單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）幼體的急性毒性效應(yīng)。試驗結(jié)果表明，單環(huán)刺螠幼體中毒后體色變暗，對外界刺激變得不敏感，最后身體縮成一團或細(xì)線狀。隨著氨氮和亞硝酸鹽質(zhì)量濃度升高死亡率逐漸升高，存在明顯的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)。氨氮對單環(huán)刺螠幼體96 h半致死質(zhì)量濃度分別為620.79 mg/L（95%置信區(qū)間557.62～691.11 mg/L），安全質(zhì)量濃度為62.08 mg/L，對應(yīng)非離子氨濃度為13.85 mg/L（95%置信區(qū)間12.44～15.42 mg/L），安全質(zhì)量濃度為1.39 mg/L;亞硝酸鹽對單環(huán)刺螠幼體96 h半致死質(zhì)量濃度為243.90 mg/L（95%置信區(qū)間223.10～266.65 mg/L），安全質(zhì)量濃度為24.39 mg/L。非離子氨對單環(huán)刺螠幼體毒性大于亞硝酸鹽毒性。

關(guān)鍵詞：單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）;氨氮;亞硝酸鹽;急性毒性實驗

氨氮和亞硝酸鹽是危害養(yǎng)殖生物生命安全的重要因素。氨氮脅迫對魚類、蝦類等多種水生動物的抗氧化酶活性有顯著影響[1-3]，氨氮慢性毒性會影響大型溞（Daphnia magna）母溞的子代對毒物的敏感性[4]。海水魚類一般通過腸上皮吸收亞硝酸鹽，蓄積在體內(nèi)對自身產(chǎn)生毒害作用[5]，受低濃度亞硝酸鹽脅迫的凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）抗病能力下降，抗菌活力和溶菌活力顯著下降[6]。

本文探究了單環(huán)刺螠幼體平均體質(zhì)量（2.86±0.43）g時的氨氮和亞硝酸鹽的耐受性及其安全濃度，為單環(huán)刺螠的工廠化養(yǎng)殖水環(huán)境的控制提供數(shù)據(jù)支持。

1?材料與方法

1.1?試驗動物

單環(huán)刺螠取自大連市金普新區(qū)黃海沿海一養(yǎng)殖場，系野生親本人工繁育，平均體重（2.86±0.43）g。試驗前，單環(huán)刺螠暫養(yǎng)在底部鋪細(xì)沙的塑料水槽內(nèi)一周，使其適應(yīng)實驗室內(nèi)環(huán)境，期間每天早上投喂一次藻粉，下午換水1/2體積，氣石懸掛在水體中下層保持充氧。

1.2?試驗用水

實驗室用海水為自然海水經(jīng)沉淀砂濾處理以后靜置于儲水池內(nèi)，海水進入養(yǎng)殖間后在藍(lán)色塑料水槽中充氧備用，鹽度32.17‰～32.28‰，水溫15.1～17.3 ℃，pH值7.88～8.15，溶解氧6.40～7.40 mg/L，氨氮0.010 5～0.043 3 mg/L，亞硝酸鹽0.001 7～0.002 8 mg/L。

1.3?試驗藥品及溶液配制

試驗用氯化銨和亞硝酸鈉均采購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，為分析純。實驗前用蒸餾水分別配制成400 g/L氯化銨和200 g/L亞硝酸鹽母液，試驗開始時向養(yǎng)殖海水中添加不同體積的母液稀釋到對應(yīng)試驗組設(shè)置濃度，添加母液體積不超過養(yǎng)殖水體的5‰。

1.4?試驗方法

根據(jù)工廠化養(yǎng)殖水環(huán)境中可能存在的氨氮和亞硝酸鹽濃度和參考文獻[7-8]，設(shè)置了預(yù)實驗濃度范圍分別為200～1 000 mg/L和400～1 263 mg/L。再根據(jù)預(yù)試驗死亡率分布情況分別設(shè)置了6個氨氮和亞硝酸鹽等對數(shù)距離質(zhì)量濃度梯度，分別設(shè)置1個對照組，其中氨氮質(zhì)量濃度梯度設(shè)置為：381、526、726、1 000、1 380、1 905 mg/L，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度設(shè)置為：200、252、318、400、503、633 mg/L，每個質(zhì)量濃度組分別設(shè)置3平行組。實驗采用96 h半靜水法，實驗在3 L白色塑料小桶內(nèi)進行，加入2.5 L試驗用海水。然后加入試驗用母液至所需梯度濃度。試驗前一天，將單環(huán)刺螠從基質(zhì)細(xì)沙中挑出，選擇規(guī)格接近健康的單環(huán)刺螠幼體每桶20個，適應(yīng)過夜后第二天加入母液開始試驗。每隔24 h全量更換試驗海水及相應(yīng)藥品，保持單環(huán)刺螠幼體在相應(yīng)濃度下完成實驗。

實驗過程中，觀察單環(huán)刺螠活力情況，每24 h觀察記錄幼體死亡數(shù)目，統(tǒng)計死亡率并及時撈出死亡個體。對于單環(huán)刺螠死亡的認(rèn)定，幼體縮成一團或細(xì)線狀，被觸碰5 s后無任何反應(yīng)記做死亡。試驗進行過程不投喂。

1.5?數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用excel 2010收集記錄。然后采用機率單位法分別計算氨氮和亞硝酸鹽氮對單環(huán)刺螠的半致死質(zhì)量濃度和LC50的95%置信區(qū)間[9-10]。水體中非離子氨氮質(zhì)量濃度由氨氮質(zhì)量濃度換算得出。

安全質(zhì)量濃度按下式計算：

安全質(zhì)量濃度=0.1×96 h LC50

式中：LC50為半致死質(zhì)量濃度。

2?結(jié)果與分析

2.1?中毒情況觀察

單環(huán)刺螠幼體在不同濃度的氨氮和亞硝酸鹽海水中身體行為反應(yīng)差異不大。初入實驗水體中，身體會伸縮翻轉(zhuǎn)，之后會適應(yīng)水環(huán)境，在水體底部緩慢蠕動，偶爾到水體中層，無激烈運動。中毒后的單環(huán)刺螠幼蟲活力明顯下降，體色變暗，對外界反應(yīng)不敏感，觸動后反應(yīng)慢或無反應(yīng)，接著腸容物排出體外，最后身體縮成一團或者呈細(xì)線狀直至死亡。

2.2?氨氮對單環(huán)刺螠幼體的急性毒性效應(yīng)

氨氮對單環(huán)刺螠幼體的急性毒性效應(yīng)見表1、表2。由表1可知，隨著試驗藥物質(zhì)量濃度的提高和藥物脅迫時間的延長，氨氮對單環(huán)刺螠幼體的急性毒性效應(yīng)明顯增強，死亡率明顯升高。由表2可知，氨氮脅迫單環(huán)刺螠幼體24 h時半致死濃度為1 263.49 mg/L;當(dāng)達到96 h時，半致死濃度為620.79 mg/L，僅為脅迫24 h的49.13%。對應(yīng)氨氮濃度的非離子氨急性毒性效應(yīng)規(guī)律一致。非離子氨對單環(huán)刺螠幼體急性毒性效應(yīng)，當(dāng)達到24 h時，半致死濃度為28.19 mg/L，當(dāng)達到96 h時，半致死濃度為13.85 mg/L，僅為脅迫24 h的49.13%。這表明氨氮和非離子氨對單環(huán)刺螠幼體的致毒效應(yīng)隨著藥物脅迫時間的延長而增加。

采用96 h半致死質(zhì)量濃度乘以安全系數(shù)0.1，作為安全質(zhì)量濃度，計算得到氨氮對單環(huán)刺螠幼體的安全質(zhì)量濃度為62.08 mg/L，非離子氨氮對單環(huán)刺螠幼體的安全質(zhì)量濃度為1.39 mg/L。

2.3?亞硝酸鹽對單環(huán)刺螠的急性毒性效應(yīng)

亞硝酸鹽對單環(huán)刺螠幼體的急性毒性效應(yīng)見表3、表4。由表3可知，隨著試驗藥物質(zhì)量濃度的提高和藥物脅迫時間的延長，亞硝酸鹽對單環(huán)刺螠幼體的急性毒性效應(yīng)明顯增強，死亡率明顯升高。由表4可知，當(dāng)達到24 h時，半致死濃度為419.98 mg/L，當(dāng)達到96 h時，半致死濃度為243.90 mg/L，為脅迫24 h的58.07%。這表明亞硝酸鹽對單環(huán)刺螠幼體的致毒效應(yīng)隨著藥物脅迫時間的延長而增加。

采用96 h半致死質(zhì)量濃度乘以安全系數(shù)0.1，作為安全質(zhì)量濃度，計算得到亞硝酸鹽對單環(huán)刺螠幼體的安全質(zhì)量濃度為24.39 mg/L。

3?討論

3.1?單環(huán)刺螠對氨氮毒性反應(yīng)

養(yǎng)殖環(huán)境中氨氮有兩大主要來源，一是含氮有機物的分解，如糞便和殘餌的分解;二是水生動物代謝排出，魚類代謝蛋白質(zhì)排泄氨氮[11]。氨氮主要以非離子氨和離子氨兩種形式存在，因溫度和pH的不同影響兩者互相轉(zhuǎn)化的效率，其中非離子氨毒性遠(yuǎn)大于離子氨毒性[1]。非離子氨具有不帶電荷、半徑小、脂溶性強等特點，損害養(yǎng)殖生物的代謝和免疫系統(tǒng)，最終引起動物死亡[12]。養(yǎng)殖生物中一般規(guī)律，大個體較小個體對氨氮毒性耐受性強，因此研究生物幼體期氨氮的毒性效應(yīng)可以作為該品種整個生活史養(yǎng)殖技術(shù)的參考數(shù)據(jù)。

當(dāng)單環(huán)刺螠幼體受到氨氮脅迫后，活動減弱、體色變淡、慢慢縮成一團或線狀，中毒嚴(yán)重直至死亡。較多的研究認(rèn)為氨氮能降低魚類載氧能力[13-14]，降低甲殼類和軟體動物的代謝活動[15-16]。龍虎斑（Epinephelus lanceolatus ♂ × Epinephelus fuscoguttatus ♀）[17]和斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）[18]的研究中均發(fā)現(xiàn)，氨氮損傷了鰓組織，從而影響氧氣的交換。墨吉明對蝦（Fenneropenaeus merguiensis）的研究表明氨氮降低了對蝦的免疫酶活性[19]，菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）幼體受氨氮脅迫后畸形率、死亡率明顯上升，生長性能下降[20]。對單環(huán)刺螠幼體氨氮中毒表現(xiàn)的觀察，高濃度氨氮條件下對應(yīng)非離子氨濃度也高，非離子氨易于通過細(xì)胞膜產(chǎn)生毒性效應(yīng)[21]，幼體體色變淺、活動減慢都是代謝活動受到影響。

非離子氨對生物的毒性受多個因素影響，如生物種類大小[22]、水體溶氧[23]、鹽度[24]和pH等。現(xiàn)階段關(guān)于海洋生物非離子氨的急性毒性的研究多集中于幼體，在正常海水條件下其中刺參（Apostihopus japonicus）[25]、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）[22]、墨吉明對蝦[19]、偏頂蛤（Modiolus modiolus）[26]、西施舌（Coelomactra antiquata）[27]、龍虎斑[17]、暗紋東方鲀（Takifugu fasciatus）[11]和大黃魚（Pseudosciaena crocea）[28]的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為7.99、2.57、3.25、14.06、0.903、1.24、0.46和0.015 mg/L。本試驗中，非離子氨對單環(huán)刺螠幼體96 h半致死質(zhì)量濃度為13.85 mg/L，僅與偏頂蛤96 h半致死質(zhì)量濃度濃度接近，遠(yuǎn)高于其它生物，說明單環(huán)刺螠幼體對非離子氨有著較強的耐受性。

3.2?單環(huán)刺螠對亞硝酸鹽毒性反應(yīng)

在集約化養(yǎng)殖環(huán)境中，亞硝酸鹽主要是水環(huán)境中硝化作用和脫氮作用不平衡產(chǎn)生的。特別是當(dāng)水體溶氧較低時，在硝化作用下水體中亞硝酸鹽濃度會增加，危害養(yǎng)殖生物健康[29]。亞硝酸鹽進入生物血液系統(tǒng)能降低載氧蛋白與氧的親和力，是其毒性的主要體現(xiàn)，此外還會影響魚類的免疫酶活性和神經(jīng)系統(tǒng)等[30]。汪家鑫研究紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）亞硝酸鹽亞急性毒性的實驗結(jié)果表明脅迫4周后的紅鰭東方鲀肝臟抗氧化酶活性明顯受到抑制[31]。有關(guān)墨吉明對蝦的毒性研究發(fā)現(xiàn)受到脅迫的墨吉明對蝦SOD活力受到抑制[32]。亞硝酸鹽對銀鯛（Sparus sarba）亞急性毒性試驗表明對魚體滲透壓和熱休克蛋白的表達有明顯影響[33]。

單環(huán)刺螠亞硝酸鹽急性毒性反應(yīng)和氨氮的毒性反應(yīng)表現(xiàn)結(jié)果類似。中毒狀態(tài)的單環(huán)刺螠幼體血液載氧能力和基礎(chǔ)代謝受到亞硝酸鹽的影響，導(dǎo)致單環(huán)刺螠生理活動受到影響。

因為亞硝酸鹽是硝酸鹽和氨氮轉(zhuǎn)換的中間產(chǎn)物，這個化學(xué)平衡受到水環(huán)境指標(biāo)和消化細(xì)菌數(shù)量影響，不同生物種類大小對其耐受性也不相同。羅杰等[34]研究表明亞硝酸鹽的毒性隨pH和鹽度降低對管角螺（Hemifusus tuba）稚貝毒害作用變大。氧氣充足能提高大菱鲆（Scophthalmus maximus）對亞硝酸鹽的耐受力[35]。在正常海水條件下，多個研究生物幼體亞硝酸鹽急性毒性的實驗結(jié)果，斜帶石斑魚[18]、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）[31]、花鱸（Lateolabax maculatus）[36]、龍虎斑[17]、大黃魚[28]、偏頂蛤[26]、中華絨螯蟹（Eriocheir sinenisis）[15]和日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）[37]的96 h半致死質(zhì)量濃度分別為208.4、159.25、58.62、90.41、50.06、54.20、52.69和427.39 mg/L。本試驗中，單環(huán)刺螠幼體亞硝酸鹽96 h半致死質(zhì)量濃度為243.90 mg/L。其96 h半致死質(zhì)量濃度與斜帶石斑魚接近，明顯小于日本囊對蝦，大于其它種類生物。說明單環(huán)刺螠對亞硝酸鹽耐受性較好。

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Acute toxicity test of ammonia nitrogen and nitrite on Urechis Unicinctus larva

ZHANG Saisai，SONG Xiaoyang，SHANG Hongxin，SUN Yang，ZHOU Zhujun，YANG Tingting，TIAN Bin，SONG Luojia，CHEN Wenbo，LIU Tong

（1.Dalian Modern Agricultural Production Development Service Center，Dalian 116023，China;2.College of Biological Science and Technology，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）

Abstract：Under the conditions of water temperature 15.1～17.3 ℃，pH 7.88～8.15，salinity 32.17‰～32.28‰，and dissolved oxygen 6.40～7.40 mg/L，the method of half static water was adopted to study the acute toxicity effects of ammonia nitrogen and nitrite on Urechis unicinctus larva with a body mass of （2.86+0.43）g.Test results showed that after being poisoned，

the Urechis unicinctus larva got a darker body color and became less sensitive to external stimuli，eventually huddling itself into a ball or a fine line.With the increase of the mass concentration of ammonia nitrogen and nitrite，the lethality rate gradually increased，so it was apparent that there existed a dose effect and a time effect.As for the effects of ammonia nitrogen on the Urechis unicinctus larva，the 96 h lethal concentration 50 （LC50） was 620.79 mg/L（95% confidence interval 557.62～691.11 mg/L） with a safety mass concentration of 62.08 mg/L，the corresponding non-ionic ammonia concentration was 13.85 mg/L （95% confidence interval 12.44～15.42 mg/L） with a safety mass concentration of 1.39 mg/L; as for the effects of nitrite on the Urechis unicinctus larva，the 96 h LC50 was 243.90 mg/L （95% confidence interval 223.10～266.65 mg/L） with a safety mass concentration of 24.39 mg/L.Non-ionic ammonia is more toxic to the Urechis unicinctus larva than nitrite.

Key words：Urechis unicinctus; ammonia nitrogen; nitrite; acute toxicity test

（收稿日期：2020-06-28）