四種特殊染色在淚道放線菌感染診斷中的應(yīng)用

楊琦 畢穎文 蔡蓉蓉

摘要：目的 ?探討六胺銀、PAS、革蘭染色和抗酸染色4種特殊染色在淚道放線菌感染診斷中的應(yīng)用。方法 ?收集2010年12月～2019年6月復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科收治的淚道放線菌感染患者30例，分析該病六胺銀、PAS、革蘭染色、抗酸染色4種特殊染色方法的鏡下表現(xiàn)。結(jié)果 ?常規(guī)HE染色鏡下下可見(jiàn)散在菌落樣結(jié)構(gòu)，菌絲結(jié)構(gòu)不清，染色淺淡;六胺銀、PAS和革蘭染色3種特殊染色方法，鏡下均可見(jiàn)放線菌分別呈棕黑色、紫紅色和紫藍(lán)色，呈陽(yáng)性染色;并于低倍鏡下可見(jiàn)放線菌菌落呈典型的菊花樣外觀，高倍鏡下可見(jiàn)放線菌菌絲。抗酸染色示，鏡下所有組織細(xì)胞均呈藍(lán)色，無(wú)特異性呈陰性染色。結(jié)論 ?六胺銀、PAS、革蘭染色及抗酸染色的聯(lián)合應(yīng)用有助于淚道放線菌感染的診斷及鑒別診斷。

關(guān)鍵詞：淚道炎;放線菌;六胺銀;PAS革蘭染色;抗酸染色

中圖分類號(hào)：R777.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.055

文章編號(hào)：1006-1959（2020）11-0168-03

Abstract：Objective ?To explore the application of four special stains of hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain in the diagnosis of lacrimal actinomycete infection.Methods ?A total of 30 patients with lacrimal actinomyces infection admitted to the Department of Ophthalmology， Otolaryngology and Affiliated Hospital of Fudan University from December 2010 to June 2019 were collected， the microscopic performance of the disease with four special staining methods including hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain was analyzed.Results ?Under the conventional HE staining microscope， scattered colony-like structures can be seen， the mycelium structure is unclear， and the staining is light; There are three special staining methods for hexaamine silver， PAS and Gram staining， and the actinomycetes can be seen under the microscope as brown-black， purple-red and purple-blue， with positive staining; The actinomycete colonies can be seen under a low magnification lens with a typical chrysanthemum-like appearance， and the actinomycete hyphae can be seen under a high power microscope. Acid-fast staining showed that all tissue cells were blue under the microscope， and there was no specific negative staining.Conclusion ?The combined application of hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain is helpful for the diagnosis and differential diagnosis of lacrimal actinomycete infection.

Key words：Lacrimal inflammation;Actinomycetes;Hexaaminesilver;PAS Gram stain;Acid-fast stain

淚道感染（lacrimal duct infection）是眼部常見(jiàn)的炎癥性病變，主要癥狀為溢淚，粘性或膿性分泌物及結(jié)膜充血，常見(jiàn)的致病菌為金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，常規(guī)采用淚道沖洗并配合抗生素滴眼液治療。淚道放線菌感染比較少見(jiàn)，臨床表現(xiàn)同淚道細(xì)菌感染相似，僅淚道沖洗及抗生素治療效果常無(wú)效，須經(jīng)淚道切開(kāi)，將放線菌形成的小菌落即硫磺顆粒取出，再行注藥并配合抗生素滴眼液治療。因此精確的診斷對(duì)患者的后續(xù)治療至關(guān)重要。放線菌屬于放線菌屬[1]，常寄生于人體的口腔、扁桃體隱窩、上呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道等多個(gè)器官或組織，是一種條件致病菌，當(dāng)身體抵抗力降低時(shí)或條件適合其生長(zhǎng)時(shí)，便明顯增殖，出現(xiàn)臨床癥狀，導(dǎo)致局部組織的化膿性炎癥[2]。在培養(yǎng)基上培養(yǎng)放線菌，其形態(tài)結(jié)構(gòu)難與真菌相鑒別，因此，組織病理檢測(cè)及其特殊染色對(duì)于放線菌的診斷尤為重要。本研究通過(guò)分析我院30例淚道放線菌感染病例，分析六胺銀、PAS、革蘭染色和抗酸染色四種特殊染色診斷淚道放線菌感染的特點(diǎn)，以期為指導(dǎo)臨床治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 ?收集2010年12月～2019年6月復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院30例眼科收治的診斷結(jié)果為淚道放線菌感染病例。其中女24例，男6例;年齡39～85歲，平均年齡64.6歲;左眼9例，右眼13例，雙眼1例，左右眼情況不詳7例。最常見(jiàn)入院癥狀為流淚，溢淚增多，其次為粘液樣分泌物伴黃白色分泌物和流膿，部分伴有眼紅眼痛和異物感?；颊咝袦I道切開(kāi)術(shù)后見(jiàn)放線菌顆粒，亦稱硫磺顆粒，常規(guī)病理送檢，并進(jìn)行HE染色和六胺銀、PAS、革蘭染色、抗酸染色四種特殊染色。

1.2方法 ?患者行淚道切開(kāi)術(shù)取出放線菌形成的小菌落樣結(jié)構(gòu)即硫磺顆粒，并送檢，標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，經(jīng)梯度脫水和梯度透明后浸蠟包埋，并制成厚度為4 μm的白片各5張。并分別進(jìn)行常規(guī)HE染色和六胺銀、PAS、革蘭染色、抗酸染色四種特殊染色（所有試劑盒均來(lái)源于珠海貝索公司）。

1.2.1 HE染色 ?操作方法：①切片常規(guī)脫蠟至水;②58 ℃熱蘇木素染色2～3 min后流水沖洗。③鹽酸酒精分化2～3 s，流水沖洗;④溫水10 s返藍(lán);⑤95%酒精浸泡2 min;⑥直接入醇溶性伊紅染液15～30 s;⑦梯度脫水透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.2六胺銀染色 ?操作方法：①工作液配置：50 ml硼砂溶液+0.5 g六次甲基四胺銀粉劑，用力搖勻5～10 min，再將六次甲基四胺銀液全部倒入硼砂溶液中，重復(fù)此步驟3次，確保六次甲基四胺銀內(nèi)粉劑被充分溶解;②將切片常規(guī)脫蠟至水;③將高碘酸滴到玻片上充分覆蓋組織并氧化10分鐘后蒸餾水沖洗2 min;④將沖洗好的玻片放入裝有染色液的試劑缸中，再放到盛有60 ℃熱水的容器瓶并置于85 ℃烘箱中約20～30 min，直至切片在黃棕色的背景中見(jiàn)到黑棕色反應(yīng)，如果顏色不夠深可以再放回染色液中。⑤硫代硫酸鈉處理3 min，水洗;⑥伊紅復(fù)染30 s;⑦常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.3 PAS染色操作方法 ?①常規(guī)脫蠟至水;②將高碘酸滴到玻片上充分覆蓋組織并氧化10 min，水洗;③將雪夫試劑滴到玻片上并充分覆蓋組織，染色10～15 min，水洗;④蘇木素液染核2 min;⑤常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.4革蘭染色 ?操作方法：①常規(guī)脫蠟至水;②滴加龍膽紫液染10～15 s，水洗;③玻片滴加碘溶液，并充分覆蓋組織，染色10～15 s，水洗;④加脫色液（丙酮、乙醇）脫色20～30 s，水洗;⑤沙黃溶液復(fù)染15 s，水洗;⑥常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。

1.2.5抗酸染色 ?操作方法：①常規(guī)脫蠟至水;②滴加石炭酸復(fù)紅染液蓋滿玻片;染色10～15 min，水洗;③滴加酸性酒精溶液，脫色1～2 min，直至組織無(wú)可視紅色為止，水洗;④滴加亞甲基藍(lán)溶液于玻片上并充分覆蓋組織，染色2 min，水洗;⑤常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封固。

2結(jié)果

HE鏡下可見(jiàn)急慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，出血，部分可見(jiàn)嗜伊紅無(wú)結(jié)構(gòu)分泌物，并均可見(jiàn)散在的中間藍(lán)色，周圍紅色，顏色淺淡的菌落樣結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖1;六胺銀染色：30例組織鏡下均見(jiàn)菌落及菌絲呈黑棕色，菌落呈菊花樣外觀。背景棕黑色，對(duì)比鮮明，見(jiàn)圖2;PAS 染色：30例組織鏡下均見(jiàn)菌落及菌絲呈紫紅色，菌落呈菊花樣外觀，對(duì)比鮮明，見(jiàn)圖3;革蘭染色 ?30例組織鏡下均見(jiàn)紫藍(lán)色菌絲及菊花樣菌落結(jié)構(gòu)，見(jiàn)圖4;抗酸染色：30例組織均呈陰性（鏡下所有組織均呈藍(lán)色），見(jiàn)圖5。

3討論

放線菌為革蘭陽(yáng)性厭氧或微需氧菌，生長(zhǎng)緩慢，無(wú)芽孢，致病菌多為衣氏放線菌[3]。放線菌感染多為慢性無(wú)痛性，常伴有多發(fā)瘺管形成，可排出黃色硫磺顆粒，將硫磺顆粒置于玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕壓平后顯微鏡檢查，可見(jiàn)顆粒呈菊花狀，由棒狀長(zhǎng)菌絲呈放射狀排列[1]。本研究發(fā)現(xiàn)淚道放線菌感染臨床并不常見(jiàn)，其主要癥狀包括溢淚、粘性及膿性分泌物，因臨床癥狀不典型，易被誤診，臨床需注意與功能性溢淚、淚囊憩室、淚囊囊腫和結(jié)膜炎相鑒別。在淚小點(diǎn)或淚道處出現(xiàn)“硫磺顆?！保ńY(jié)石樣物）這一現(xiàn)象是淚道放線菌感染的特征性的病理改變[5]，常由患者機(jī)體抵抗力下降后內(nèi)源性感染引起。本研究中老年的女性居多可能與該年齡段患者抵抗力相對(duì)較差有關(guān)。

放線菌菌培養(yǎng)的陽(yáng)性率較低，僅在50%左右，病理診斷是放線菌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[6]。以往關(guān)于放線菌病理診斷及鑒別診斷方面的研究?jī)H為一種或兩種特殊染色的個(gè)例或小樣本的系列研究，本組是四種特殊染色聯(lián)合應(yīng)用的較大的樣本研究。淚道放線菌感染送檢標(biāo)本的常規(guī)HE染色結(jié)果，鏡下可見(jiàn)急慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有的可見(jiàn)嗜伊紅均質(zhì)分泌物，并可見(jiàn)散在菌落樣物，但菌落及菌絲染色淺淡，缺乏特異性，不僅觀察困難，而且容易漏診。此外，六胺銀染色能夠?qū)Ψ啪€菌及其菌落進(jìn)行很好的染色，對(duì)比清晰，低倍鏡下，放線菌菌落呈典型的菊花樣結(jié)構(gòu)，高倍鏡下可見(jiàn)黑棕色菌絲呈放射狀排列，對(duì)診斷結(jié)果至關(guān)重要，缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)工作液不能接觸金屬離子，所以沖洗液最好選用蒸餾水，同時(shí)高碘酸沖洗要充分，避免造成嚴(yán)重背景色，并且染色時(shí)間不好掌握，容易過(guò)染，耗材貴。本組PAS染色，放線菌菌落呈菊花樣外觀，菌絲呈紫紅色，耗時(shí)短，操作簡(jiǎn)單，是準(zhǔn)確性高，時(shí)效性好的特殊染色方法。本組革蘭染色，放線菌呈紫藍(lán)色，主要用于同革蘭陰性菌相鑒別。臨床上，大多數(shù)放線菌的革蘭染色只用于細(xì)胞涂片或者細(xì)菌培養(yǎng)后的特殊染色。從組織學(xué)角度對(duì)組織內(nèi)的放線菌進(jìn)行革蘭染色，得到了同樣好的染色結(jié)果。本組抗酸染色的主要作用在于將放線菌與麻風(fēng)桿菌和結(jié)核桿菌相鑒別，也佐證了放線菌呈抗酸染色陰性。因此在常規(guī)HE下發(fā)現(xiàn)中間藍(lán)色，周圍紅，染色淺淡的菌落樣結(jié)構(gòu)，并配合四種特殊染色的染色結(jié)果，即在六胺銀、PAS、革蘭染色中，低倍鏡下觀察到典型的菊花樣外觀的菌落及高倍鏡下看到桿狀菌絲呈放射狀排列并呈陽(yáng)性著色;同時(shí)抗酸染色看不到陽(yáng)性著色即可診斷為放線菌感染。

本組關(guān)于淚道炎放線菌感染與其他菌群相鑒別的研究發(fā)現(xiàn)，淚道炎的致病菌按革蘭染色結(jié)果和形態(tài)可分為革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陽(yáng)性桿菌、革蘭陰性球菌和革蘭陰性桿菌以及真菌和放線菌。①放線菌與革蘭陰性菌（革蘭陰性球菌和革蘭陰性桿菌）相鑒別：放線菌為革蘭陽(yáng)性菌，利用革蘭染色結(jié)果，可將其與革蘭陰性菌相鑒別。②放線菌與革蘭陽(yáng)性菌（革蘭陽(yáng)性球菌和革蘭陽(yáng)性桿菌）相鑒別：淚道感染中革蘭陽(yáng)性球菌較為常見(jiàn)，多見(jiàn)表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌;革蘭陽(yáng)性桿菌較少見(jiàn)，偶見(jiàn)假白喉棒狀桿菌[4];因金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和假白喉棒狀桿菌菌體太小在常規(guī)HE下難以發(fā)現(xiàn)，即使看到也是極小的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu);同時(shí)它們的六胺銀及PAS染色分別呈棕黃色和粉色背景色，呈陰性表達(dá)。結(jié)合特殊染色可以與放線菌相鑒別。表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌診斷主要靠細(xì)菌培養(yǎng)。假白喉棒狀桿菌的鑒定主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)、革蘭染色和生化實(shí)驗(yàn);③放線菌與真菌相鑒別：淚道炎常見(jiàn)的真菌為白假絲酵母菌。白假絲酵母菌為革蘭染色陽(yáng)性真菌，同時(shí)六胺銀和PAS也均呈陽(yáng)性，抗酸為陰性，但是其鏡下結(jié)構(gòu)完全不同，放線菌菌絲纖細(xì)0.1～0.5 μM 菌落呈放射狀，六胺銀和PAS染色后鏡下可見(jiàn)典型的菊花樣菌落結(jié)構(gòu)。在組織切片中，白假絲酵母菌主要位于黏膜表面的滲出物及壞死組織內(nèi)，菌體呈球形或卵圓形，直徑為3～6 μM，形成芽生孢子，孢子伸長(zhǎng)成芽管（內(nèi)有空泡樣結(jié)構(gòu)），不與母體脫離，繼而形成假菌絲。后者常帶有球狀成堆的芽生孢子，菌絲內(nèi)有核，可見(jiàn)分隔、分枝，也見(jiàn)厚膜孢子[7]。

綜上所述，六胺銀、PAS、革蘭染色及抗酸染色結(jié)果結(jié)合常規(guī)HE對(duì)放線菌的診斷及鑒別診斷有重要作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]倪語(yǔ)星，尚紅.臨床微生物檢驗(yàn)[M].第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：214-216.

[2]劉立民，高寧洲，楊蕾蕾，等.慢性淚囊炎合并放線菌淚小管炎一例[J].中國(guó)實(shí)用眼科雜志，2016，34（4）：398-399.

[3]井夢(mèng)昕，周賢梅.左上肺放線菌病一例誤診分析[J].臨床誤診誤治，2017，30（4）：15-17.

[4]孔京慧，章波，宋銀森.嬰幼兒淚囊炎1482例眼分泌物細(xì)菌培養(yǎng)及藥敏分析[J].中華眼外傷職業(yè)病雜志，2018，40（9）：699-701.

[5]Nair AG，Potdar NA，Gore SS，et al.Actinomycetes canaliculitis complicating congenital nasolacrimal duct obstruction in an infant[J].Indian J Ophthalmol，2018，66（4）：574-577.

[6]張子敬，高志清，謝波，等.腹部放線菌病1例[J].中國(guó)感染與化療雜志，2018，18（3）：309-311.

[7]鄭葉，曾東，童海濤，等.特殊染色技術(shù)在艾滋病合并真菌病理診斷中的應(yīng)用[J].中華臨床感染雜志，2004，7（3）：207-211.

[8]Chou YP，Yeh PH，Tsai YJ，et al.Infectious keratitis secondary to canaliculitis with concretions：A case report[J].Medicine（Baltimore），2019，98（40）：e17444.

收稿日期：2020-02-27;修回日期：2020-04-18

編輯/馮清亮