芍藥種胚啟動培養(yǎng)及叢生芽誘導(dǎo)研究

劉雪婷 ，孫曉梅 ，李 妍 ，李 恒 ，李雪婷 ，宋莉莉

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，沈陽110161；2.鞍山創(chuàng)融發(fā)展有限公司，遼寧 鞍山114017）

芍藥（Paeonia lactiflora）為芍藥科芍藥屬多年生宿根草本植物，集觀賞、藥用、食用、經(jīng)濟(jì)價值于一體，是中國栽培歷史最悠久的花卉之一。芍藥傳統(tǒng)的繁殖方法包括播種、分株、扦插等，但上述方法易受季節(jié)限制，繁殖系數(shù)低，難以滿足花卉市場的需求[1-2]。與傳統(tǒng)繁殖方式相比，組織培養(yǎng)技術(shù)不僅可以提高繁殖系數(shù)，縮短育種時間，也可以為新品種的繁育、遺傳轉(zhuǎn)化、生理生化以及野生種質(zhì)資源保存提供科學(xué)依據(jù)[3-4]。目前，芍藥的組織培養(yǎng)包括叢生芽、愈傷組織誘導(dǎo)再分化不定芽以及體細(xì)胞胚胎3種途徑。芍藥愈傷組織途徑存在再分化困難、褐化、玻璃化等問題，很難形成完整的植株[5]。芍藥的體胚誘導(dǎo)及成熟過程相較于其他植物，對培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑及培養(yǎng)條件要求更加嚴(yán)格，不易誘導(dǎo)[6-7]。通過芍藥種胚進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)可以縮短育苗周期，短時間內(nèi)可獲得大量的叢生芽苗，目前已取得了一定的進(jìn)展。杜霞[5]對杭白芍的種胚進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，增殖系數(shù)為1.27；張滕等[4]以“粉玉奴”及“杭白芍”的種胚進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，均獲得質(zhì)量較好的叢生芽苗。但叢生芽誘導(dǎo)過程中仍存在芽苗畸形、誘導(dǎo)率及增殖率較低等現(xiàn)象。本試驗以芍藥種胚為外植體，采用組織培養(yǎng)的方法，對種胚的啟動培養(yǎng)、叢生芽誘導(dǎo)及增殖過程進(jìn)行研究，以期為實現(xiàn)芍藥高效擴(kuò)繁、遺傳轉(zhuǎn)化及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗采用的雜交種子（母本為粉玉奴、父本為粉玉樓）來自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)芍藥資源圃，于2018年5月22日授粉，8月23日采集種子，陰干后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。胚齡試驗的種子采于2019年5月23日授粉后的不同時期，即采即用。

1.2 方法

1.2.1 種胚最佳啟動培養(yǎng)基的篩選 無菌水中浸泡種子48h后，剝?nèi)ネ鈱臃N皮，在無菌操作臺中用75%酒精消毒30s，0.1%HgCl2消毒5min，無菌水沖洗3次，切成3mm×3mm帶有種胚的胚乳塊，分別接種于表1的培養(yǎng)基中，每個處理30個外植體，重復(fù)3次，以A0為對照。10d后觀察種胚的萌發(fā)率，15d后觀察胚苗的萌發(fā)狀態(tài)。

1.2.2 暗培養(yǎng)誘導(dǎo)種胚萌發(fā)試驗 種子處理方式同1.2.1。 接種在添加 0.5mg·L-1GA3、1.0mg·L-16-BA 的 MS培養(yǎng)基中，分別進(jìn)行光培養(yǎng)（光照時間為14h·d-1）及兩種暗處理培養(yǎng)（暗培養(yǎng)4d后轉(zhuǎn)到正常光照條件下；暗培養(yǎng)8d后轉(zhuǎn)到正常的光照條件下），10d后觀察種胚的萌發(fā)率，15d觀察胚苗的萌發(fā)狀態(tài)。

1.2.3 胚齡誘導(dǎo)種胚萌發(fā)試驗 分別取授粉后65，75，85，95d的種子，處理后接種到添加 0.5mg·L-1GA3、1.0mg·L-16-BA的MS培養(yǎng)基中，10d后觀察種胚的萌發(fā)率，25d后觀察胚苗的萌發(fā)狀態(tài)。

1.2.4 種胚及子葉節(jié)叢生芽的初步誘導(dǎo)試驗 將啟動培養(yǎng)中萌發(fā)的完整胚苗轉(zhuǎn)接到表2的叢生芽初步誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)30d后，觀察叢生芽萌發(fā)趨勢，篩選種胚初步誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基。將切除胚根的子葉節(jié)轉(zhuǎn)接到種胚叢生芽初步誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察兩種外植體初步誘導(dǎo)叢生芽的差異。

表1 芍藥種胚啟動培養(yǎng)試驗設(shè)計Table 1 Experimental design of initiation culture of peony embryo

表2 芍藥種胚叢生芽初步誘導(dǎo)試驗設(shè)計Table 2 Preliminary induction experiment design of multiple shoots of peony embryo

1.2.5 種胚及子葉節(jié)叢生芽的二次誘導(dǎo)試驗 以初步誘導(dǎo)中有叢生芽趨勢的胚苗為試驗材料，轉(zhuǎn)接到表3所示的培養(yǎng)基中進(jìn)行種胚叢生芽的二次誘導(dǎo)，30d后觀察叢生芽發(fā)育狀態(tài)，篩選最適合種胚叢生芽二次誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。將初步誘導(dǎo)中的子葉節(jié)叢生芽轉(zhuǎn)接到篩選出的最適培養(yǎng)基中，進(jìn)行子葉節(jié)叢生芽二次誘導(dǎo)，觀察兩種外植體二次誘導(dǎo)中叢生芽的差異。

1.2.6 水解酪蛋白對叢生芽增殖的影響 將誘導(dǎo)出的叢生芽苗轉(zhuǎn)接到3.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3+0.1mg·L-1NAA+1.0g·L-1PVP的MS培養(yǎng)基中，并添加不同濃度的水解酪蛋白CH（0，0.3，0.5g·L-1），30d后觀察水解酪蛋白濃度對叢生芽增殖的作用。

1.2.7 NAA對叢生芽的增殖試驗 將誘導(dǎo)出的叢生芽苗轉(zhuǎn)接到3.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3+0.3g·L-1CH+1.0 g·L-1PVP 的 MS 培養(yǎng)基中，并添加不同濃度的 NAA（0.05，0.1，0.2，0.3mg·L-1），30d 后觀察生長素濃度對叢生芽增殖的作用。

表3 芍藥種胚叢生芽二次誘導(dǎo)試驗設(shè)計Table 3 Secondary induction experiment design of multiple shoots of peony embryo

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥種胚的啟動培養(yǎng)

2.1.1 不同激素組合對芍藥種胚啟動培養(yǎng)的影響 由表4可知，A1處理種胚萌發(fā)率最高，為71.94%；其次為A3處理，萌發(fā)率為63.89%，均顯著高于未添加GA3的A0、A2處理（p＜0.05）。表明GA3對提高芍藥種胚的萌發(fā)率具有顯著作用。然而隨培養(yǎng)時間的增加，只添加GA3的A1處理胚根生長緩慢甚至停止生長，而添加GA3與6-BA的A3處理胚苗長勢良好，子葉間有腋芽產(chǎn)生。A5處理是A3處理的基礎(chǔ)上添加0.2mg·L-1NAA，其萌發(fā)率顯著低于A3處理，胚根基部增粗，影響胚苗生長。表明NAA對芍藥種胚啟動培養(yǎng)無作用，甚至抑制種胚的萌發(fā)。綜上，種胚的最佳啟動培養(yǎng)基為MS+0.5mg·L-1GA3+1.0mg·L-16-BA。

表4 植物生長調(diào)節(jié)劑對芍藥種胚啟動培養(yǎng)的影響Table 4 Effects of plant growth regulators on initiation culture of peony embryo

2.1.2 暗培養(yǎng)對種胚萌發(fā)的影響 由表5可知，暗培養(yǎng)4d時種胚萌發(fā)率最高，為73.47%，略高于正常光照下69.16%的萌發(fā)率，差異不顯著。暗培養(yǎng)8d的種胚，萌發(fā)率下降為52.31%，顯著低于另外兩種處理（p＜0.05）。

培養(yǎng)15d后，3種暗處理下的種胚均可脫離胚乳獨立生長。此時，正常光照培養(yǎng)的胚苗，子葉偏淺綠色閉合狀態(tài)，胚軸為白色，生長速度稍慢于經(jīng)過暗培養(yǎng)的胚苗（圖1A）。經(jīng)過暗培養(yǎng)處理的胚苗，子葉均偏粉，正常展開并進(jìn)行伸長生長（圖1B和圖1C）。綜上，短期暗培養(yǎng)可以改善胚苗的發(fā)育狀態(tài)，若暗培養(yǎng)時間過長，種胚的萌發(fā)率及成苗率均會降低。因此，暗培養(yǎng)4d為種胚萌發(fā)的最佳暗處理時間。

表5 暗培養(yǎng)對種胚萌發(fā)的影響Table 5 Effect of dark culture on seed embryo germination

圖1 不同暗培養(yǎng)處理15d后種胚的發(fā)育狀態(tài)Figure 1 Development status of embryo after 15 days in different dark culture treatments

2.1.3 胚齡對種胚萌發(fā)的影響 由圖2可知，種胚的萌發(fā)率隨胚齡的增加呈先增加后降低的趨勢。當(dāng)胚齡為65d時種胚的萌發(fā)率最低，僅為6.67%，胚苗長勢較差，子葉皺縮彎曲。當(dāng)胚齡為75d時，萌發(fā)率最高，達(dá)到63.33%，胚苗健壯，子葉緊密貼合在一起，長勢良好。當(dāng)胚齡增加至85d或95d時，種子已趨于成熟狀態(tài)，相比于75d的萌發(fā)率差異不顯著，且發(fā)育狀態(tài)與75d無太大差異。綜上，胚齡為授粉后75～95d均適宜誘導(dǎo)種胚萌發(fā)，胚齡不宜過小，胚不易萌發(fā)。

2.2 叢生芽的誘導(dǎo)及增殖

2.2.1 初步誘導(dǎo)中GA3與6-BA濃度對種胚叢生芽的影響 由表6可知，當(dāng)GA3、6-BA濃度均為1.0mg·L-1時，種胚叢生芽的誘導(dǎo)率最高，為48.33%，顯著高于其他處理（p＜0.05），胚軸與子葉間明顯膨大，叢生芽的萌發(fā)趨勢較強，長勢較好。當(dāng)GA3、6-BA濃度降低時，誘導(dǎo)率會隨之降低，子葉節(jié)間膨大的趨勢也會降低。B1、B3處理中，6-BA的濃度均為0.5mg·L-1，此時叢生芽的誘導(dǎo)率均較低，分別為32.90%、33.95%。B2、B5組合中，6-BA的濃度均為1.0mg·L-1，誘導(dǎo)率略低于B4組合，但顯著高于B1、B3，表明6-BA的濃度對叢生芽的誘導(dǎo)具有重要的作用。B5是在B4的基礎(chǔ)上添加0.1mg·L-1NAA，胚根基部產(chǎn)生愈傷組織及瘤狀突起，降低叢生芽誘導(dǎo)率，表明NAA對叢生芽的誘導(dǎo)起抑制作用。綜上，種胚叢生芽初步誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基MS+1.0mg·L-1GA3+1.0mg·L-16-BA。

圖2 胚齡對種胚萌發(fā)的影響Figure 2 Effect of embryo age on seed embryo germination

2.2.2 初步誘導(dǎo)中子葉與種胚對叢生芽誘導(dǎo)的影響 由表7可知，子葉節(jié)叢生芽的初步誘導(dǎo)率高于種胚，為64.28%。培養(yǎng)10d后，可觀察到子葉節(jié)叢生芽明顯伸長，培養(yǎng)20d，新芽高可達(dá)到2cm，芽與芽處于分散狀態(tài)，有利于下一步的增殖分切（圖3A）。種胚叢生芽長勢略差，絕大多數(shù)都是由子葉間萌發(fā)出芽點，高度小于1cm，部分胚苗會在胚軸的周圍萌發(fā)出芽點，形狀類似于須根的狀態(tài)（圖3B）。綜上，切除胚根基部更有利于胚苗的常規(guī)生長，但完整種胚誘導(dǎo)出的叢生芽具有更高的萌發(fā)潛質(zhì)。

表6 初步誘導(dǎo)對種胚叢生芽的影響Table 6 Effects of initial induction on seed embryo multiple shoots

表7 外植體對叢生芽初步誘導(dǎo)的影響Table 7 Effects of explants on initial induction of multiple shoots

圖3 子葉節(jié)叢生芽與種胚叢生芽對比Figure 3 Comparison between cotyledon node and embryo initial induction of multiple shoots

2.2.3 二次誘導(dǎo)中6-BA的濃度對種胚叢生芽的影響 由表8可知，1.0mg·L-1GA3與4種濃度的6-BA均可誘導(dǎo)叢生芽。當(dāng)6-BA濃度為2.0mg·L-1時，種胚叢生芽誘導(dǎo)率最高，為63.89%，顯著高于其他處理，叢生芽翠綠健壯，長勢良好（圖4B）。其次是6-BA為3.0mg·L-1時，誘導(dǎo)率為51.83%，該濃度下叢生芽分化程度較高，但部分胚苗有輕微褐化（圖4C）。上述兩種處理的部分叢生芽基部會膨大呈團(tuán)狀，表面有綠色凸起的芽點，可進(jìn)一步分化為叢生芽（圖4E和圖4F）。當(dāng)6-BA為1.0mg·L-1時，誘導(dǎo)率為45.94%，叢生芽健壯，但生長緩慢（圖4A）。當(dāng)6-BA為4.0mg·L-1時，誘導(dǎo)率為42.06%，叢生芽基部嚴(yán)重褐化（圖4D）。 綜上，MS+2.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1GA3為叢生芽二次誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基，將3.0mg·L-16-BA作為叢生芽增殖試驗的濃度。

2.2.4 二次誘導(dǎo)中子葉與種胚對叢生芽誘導(dǎo)的影響 由表9可知，子葉節(jié)叢生芽在二次誘導(dǎo)中的誘導(dǎo)率為52.17%，略低于種胚叢生芽。子葉節(jié)叢生芽在轉(zhuǎn)接5d后，即可觀察到叢生芽有明顯伸長的趨勢，在20d時芽高可達(dá)3cm，且各叢生芽間都處于分離狀態(tài)，芽苗纖細(xì)并未緊密貼合（圖5A），但部分子葉節(jié)叢生芽二次誘導(dǎo)時會出現(xiàn)叢生芽數(shù)量較少，迅速高生長后逐步萎蔫的現(xiàn)象，影響后期芽苗的增殖質(zhì)量（圖5B）。種胚叢生芽二次誘導(dǎo)的生長速度較慢，轉(zhuǎn)接15d后可觀察到新芽萌發(fā)，叢生芽緊密貼合，植株健壯，長勢較好（圖5C）。綜上，種胚叢生芽的二次誘導(dǎo)效果優(yōu)于子葉節(jié)叢生芽。

圖4 不同激素濃度下種胚叢生芽二次誘導(dǎo)狀態(tài)Figure 4 The state of secondary induction of embryo multiple shoots under different hormone concentrations

表9 外植體對叢生芽二次誘導(dǎo)的影響Table 9 Effects of explants on secondary induction of multiple shoots

2.2.5 水解酪蛋白對叢生芽增殖的影響 由表10可知，當(dāng)水解酪蛋白濃度為0.3g·L-1時，平均增殖系數(shù)最高，為2.29，該濃度下胚苗翠綠健壯，叢生芽數(shù)量多，且生長速度快（圖6B）。當(dāng)濃度為0時，叢生芽數(shù)量會減少，長勢良好，但生長速度慢（圖6A）。當(dāng)濃度為0.5g·L-1時，叢生芽會在胚軸周圍橫向增殖，但并未伸長生長，隨著培養(yǎng)時間增加，莖葉逐漸枯萎，植株嚴(yán)重褐化，未能進(jìn)一步生長（圖6C）。綜上，在一定濃度范圍內(nèi)，水解酪蛋白可以促進(jìn)叢生芽的增殖生長，最適宜的濃度為0.3g·L-1。

圖5 子葉節(jié)叢生芽與種胚叢生芽對比Figure 5 Comparison between cotyledon node and embryo secondary induction of multiple shoots

表8 二次誘導(dǎo)對種胚叢生芽的影響Table 8 Effects of secondary induction on embryo multiple shoots

圖6 不同濃度水解酪蛋白處理下叢生芽增殖狀態(tài)Figure 6 The state of proliferation from multiple shoots under different concentrations of hydrolyzed casein

表10 水解酪蛋白對叢生芽增殖的影響Table 10 Effect of acid hydrolysis of casein on the proliferation of multiple shoots

2.2.6 NAA對叢生芽增殖的影響 研究發(fā)現(xiàn)，NAA對叢生芽的增殖率無顯著影響，但其濃度變化可以影響叢生芽苗的質(zhì)量。由表11可知，當(dāng)NAA的濃度為0.05mg·L-1時，新芽高度小于1cm，植株健壯，但生長速度較慢；當(dāng)NAA為0.1mg·L-1時，芽苗的生長狀態(tài)最好，可明顯觀察到叢生芽伸長，且高度大于1cm。當(dāng)NAA濃度進(jìn)一步提高至0.2mg·L-1時，胚根基部凸起逐漸明顯，褐化程度逐漸加劇，新芽萎蔫。當(dāng)NAA升高為0.3mg·L-1時，褐化嚴(yán)重，培養(yǎng)一段時間后，叢生芽會枯黃萎蔫甚至停止生長。綜上，低濃度NAA可提高芽苗質(zhì)量，最適宜叢生芽增殖的NAA濃度為0.1mg·L-1。

表11 NAA對叢生芽增殖的影響Table 11 Effect of NAA on the proliferation of multiple shoots

3 討論與結(jié)論

在啟動培養(yǎng)過程中，激素起著至關(guān)重要的作用。6-BA是形成腋芽的必要條件[8]。GA3是啟動培養(yǎng)中打破種子休眠最主要的因素[9-10]。前人多選用GA3與6-BA組合對種胚進(jìn)行啟動培養(yǎng)，既可以打破上胚軸休眠又可以刺激莖的伸長[11]。本試驗結(jié)論與前人大致相符，但在研究過程中發(fā)現(xiàn)，單一GA3未能使種胚形成完整植株，而GA3與6-BA組合誘導(dǎo)既可提高種胚的萌發(fā)率，又產(chǎn)生新的腋芽，由此推斷，6-BA可誘導(dǎo)胚苗產(chǎn)生新芽，GA3與6-BA組合既可誘導(dǎo)種胚萌發(fā)，也可用于叢生芽的誘導(dǎo)。

目前，芍藥屬植物關(guān)于胚齡的研究多見于牡丹，有前人發(fā)現(xiàn)牡丹種胚的萌發(fā)率會隨著胚齡增加逐漸提高，盛花期后75d萌發(fā)率最高，可達(dá)到58.3%[12]。也有研究者發(fā)現(xiàn)，并非胚齡越大成活率越高，誘導(dǎo)率會隨胚齡的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在花后110 d時誘導(dǎo)率最高[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，胚齡為授粉后75～95d的誘導(dǎo)率差異不顯著，均適宜誘導(dǎo)種胚萌發(fā)，胚齡不宜過小，胚不易萌發(fā)。

有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的6-BA會使胚苗抽葉停滯，發(fā)育遲緩[5]。低濃度的GA3、6-BA組合雖然適合芍藥“粉玉奴”的叢生芽誘導(dǎo)，但叢生芽的生長速度慢，且增殖系數(shù)較低[4，15]。由此推測胚苗幼期對高濃度6-BA敏感，隨著叢生芽的分化及胚苗自身的生長，對6-BA的需求量會增加。因此，本研究采用兩步誘導(dǎo)法，使胚苗適應(yīng)由低到高的濃度變化。本試驗結(jié)果表明，種胚叢生芽的初步誘導(dǎo)最佳激素配比為MS+1.0mg·L-1GA3+1.0mg·L-16-BA；種胚二次誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-1GA3+2.0mg·L-16-BA；增殖培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L-1GA3+3.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA+0.3g·L-1CH。從誘導(dǎo)到增殖的過程中6-BA的濃度由低到高逐漸遞增，既可以提高誘導(dǎo)率，又可以降低胚苗的畸形率。

前人對子葉節(jié)誘導(dǎo)從生芽的研究較少。主要通過TDZ與6-BA對子葉節(jié)進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率過低且胚苗畸形膨大，阻礙子葉節(jié)叢生芽進(jìn)一步生長[5，16]。本試驗發(fā)現(xiàn)，種胚叢生芽的最佳誘導(dǎo)激素同樣適用于子葉節(jié)，且子葉節(jié)叢生芽的初步誘導(dǎo)狀態(tài)要優(yōu)于種胚叢生芽，但后期子葉節(jié)叢生芽的葉數(shù)量要少于種胚叢生芽，增殖后期生長狀態(tài)略差。

水解酪蛋白是由多種氨基酸組成的添加物，在植物組織培養(yǎng)的各階段均有重要的意義[17]。有人對芍藥及牡丹進(jìn)行快繁研究時發(fā)現(xiàn)，水解酪蛋白對叢生芽的增殖具有重要的作用[18-19]。李劉澤木[20]發(fā)現(xiàn)，0.25 g·L-1水解酪蛋白對伊藤雜種‘Bartzella’的組培苗具有明顯的促進(jìn)作用。以上研究結(jié)果均與本研究相符。本研究發(fā)現(xiàn)，0.3g·L-1酸水解酪蛋白可顯著提高叢生芽的增殖率。

本試驗已通過兩步誘導(dǎo)法，解決了芍藥叢生芽誘導(dǎo)率低、增殖困難的問題，獲得大量增殖的叢生芽苗，縮短了芍藥的育苗周期，但在增殖后期叢生芽的基部褐化較為明顯，會限制叢生芽生根，因此，下一步應(yīng)著重解決增殖過程中叢生芽基部褐化的問題，提高芽苗質(zhì)量，進(jìn)而誘導(dǎo)生根，實現(xiàn)芍藥叢生芽再生。

綜上，0.5mg·L-1GA3與1.0mg·L-16-BA的激素組合最適合芍藥種胚啟動培養(yǎng)，有腋芽產(chǎn)生，利于叢生芽誘導(dǎo)；授粉75d后采收的種子均適宜胚啟動培養(yǎng)；暗培養(yǎng)4d可提升胚苗的質(zhì)量。兩步進(jìn)行誘導(dǎo)可以逐步提高胚苗對高濃度激素的適應(yīng)能力，降低高濃度激素對胚苗的直接傷害。1.0mg·L-1GA3與1.0mg·L-16-BA的激素組合最適合種胚叢生芽初步誘導(dǎo)；1.0mg·L-1GA3與2.0mg·L-16-BA的激素組合最適合種胚叢生芽二次誘導(dǎo)；3.0mg·L-16-BA為叢生芽增殖最適宜的濃度，配合0.3g·L-1CH更有利于叢生芽增殖生長。完整的種胚叢生芽比子葉節(jié)叢生芽具有更高的分化程度，在二次誘導(dǎo)及增殖中效果顯著。