不同產(chǎn)地地參中總糖、可溶性多糖和還原糖含量的比較分析

黃小蘭，周祥德，楊 勤，張椿翊，何旭峰，周 濃

(1.重慶三峽學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404100；2.重慶市萬州食品藥品檢驗所，重慶 404100；3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 中醫(yī)學(xué)院，重慶 404100)

地參為唇形科地筍屬植物毛葉地筍(Lycopuslucidusvar.hirtusRegel)的干燥根莖，其性平味甘，有化瘀止血、益氣利水之功效[1]，是我國名貴的中草藥，其藥用價值在多部古籍中均有介紹?！侗静菔斑z》記載其具有利九竅、通血脈、排膿、治血等作用；《嘉佑本草》記載其能主治一切血??；《四川常用中草藥》中記載其具有調(diào)和氣血、補精髓、治頭暈的作用[2]；現(xiàn)代其作為中藥材收載于2009版《湖南省中藥材標準》[3]。地參不僅有較高的藥用價值，而且還頗具營養(yǎng)價值，其飽滿脆嫩的根莖因營養(yǎng)豐富、味道鮮美而享有“蔬菜珍品”之美譽，是一種傳統(tǒng)的藥食兼用佳品[4-5]。

研究表明，地參含有豐富的糖類、氨基酸、粗蛋白、礦物元素和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，地參中的總糖含量高達干重的40%以上，是其加工開發(fā)的主要利用物質(zhì)[6-7]。糖類物質(zhì)是植物通過光合作用合成，為自然界中一切生命體提供能量來源，是生命活動不可或缺的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。其中的多糖類成分更是因其在藥理方面的突出作用而備受關(guān)注，王文靜等[9]發(fā)現(xiàn)不同采收期的地參多糖具有較強的抗氧化作用；熊偉等[10-11]在將精制的野生地參多糖灌胃給正常和糖尿病小鼠的實驗中發(fā)現(xiàn)，地參多糖具有較好的降血糖、降血脂作用；Yang等[12]研究了地參涼茶的多糖組成及其在改善免疫系統(tǒng)方面的顯著作用。目前，對地參中糖類物質(zhì)的研究主要集中在多糖的提取測定以及生物活性方面[9-14]，尚未見其他糖類物質(zhì)的系統(tǒng)性研究。

本研究以我國云南、江蘇、山東、廣西、重慶等地參主產(chǎn)區(qū)[15]的10批樣品作為研究對象，采用苯酚-硫酸法測定總糖和可溶性多糖含量，3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法測定其還原糖的含量并進行比較研究，分析其含量分布規(guī)律，旨在為地參的綜合開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為藥材的道地性、栽培引種以及多指標質(zhì)量評價體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地參自采或委托采集于全國5個主產(chǎn)區(qū)，詳見表1，重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為唇形科地筍屬植物毛葉地筍(L.lucidusvar.hirtus)的干燥根莖。D-無水葡萄糖對照品(批號：Must-3122601，純度≥98%以上)，成都曼思特生物科技有限公司；苯酚(色譜純)，山東西亞化學(xué)股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸、鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、碘、碘化鉀等其他化學(xué)試劑均為分析純，天津光復(fù)試劑有限公司。

表1 地參產(chǎn)地信息

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器責任有限公司)；GL2202-1SCN電子天平(精度0.01 g)、SQP Sartorius電子天平(精度0.000 1 g)(德國Sartorius公司)；KH-2000DB型超聲波清洗機(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；Sigma4-16S型高速離心機(德國Sigma公司)；試驗用水為娃哈哈純凈水。

1.3 方法

1.3.1 地參樣品的預(yù)處理

預(yù)處理方法參照湖南省中藥材標準[3]，將地參洗凈泥沙，晾干水分，置于恒溫干燥箱45℃烘干至恒重，將其粉碎過35目篩，備用。

1.3.2 顯色試劑的配制

5%苯酚溶液：精密稱取5.00 g重蒸苯酚，用純凈水溶解并定容至100 mL，搖勻，轉(zhuǎn)至棕色瓶中置4℃冰箱中避光保存，備用。

DNS試劑：(1)稱取2.50 g 3,5-二硝基水楊酸，用純凈水溶解并定容至250 mL，得1% 3,5-二硝基水楊酸溶液。(2)稱取1.725 0 g重蒸苯酚溶于10%氫氧化鈉溶液中，并稀釋至17 mL，加入1.725 0 g亞硫酸氫鈉，溶解即得甲液。稱取63.75 g酒石酸鉀鈉溶于75 mL 10%氫氧化鈉溶液中，加入1% 3,5-二硝基水楊酸溶液220 mL混勻即得乙液。(3)將甲液與乙液混合搖勻即得DNS試劑，貯存于棕色試劑瓶中室溫下放置7 d后使用。

1.3.3 對照品溶液的配制

精密稱取減壓干燥至恒重的D-無水葡萄糖對照品0.171 1 g于100 mL棕色容量瓶中，用純凈水溶解并定容至刻度，得濃度為1.171 mg/mL的對照品儲備液。

1.3.4 供試品溶液的制備

1.3.4.1 總糖供試品溶液 總糖提取參照文獻[16]，稱取地參粉末0.5 g(精確至0.000 1 g)于50 mL離心管中，加入25 mL 10%鹽酸溶液，沸水浴加熱至水解完全。取1滴水解液于白瓷板上，加入1滴碘-碘化鉀試劑，水解液不顯藍色則為水解完全。取出放冷，4 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于50 mL容量瓶中，加入20 mL純凈水復(fù)提殘渣，合并上清液并定容至刻度，搖勻。精密移取1.00 mL于50 mL容量瓶中，用純凈水定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.4.2 可溶性多糖的供試品溶液 取一定量的地參粉末，加入適量石油醚(60～90℃)，在60℃水浴中回流1.5 h進行脫脂，揮干溶劑。稱取0.5 g(精確至0.000 1 g)脫脂樣品于50 mL離心管中，加入80℃蒸餾水20 mL，超聲提取60 min后取出，放至室溫，4 000 r/min離心5 min，取上清液于另一離心管中，殘渣中加水10 mL，重復(fù)提取合并上清液。加入Sevage試劑(正丁醇∶三氯甲烷=1∶5，V/V)10 mL，渦旋振蕩，離心，取上清液，加入5倍量的無水乙醇，搖勻，于4℃條件下靜置24 h，棄去上層液，用無水乙醇洗滌沉淀2次，水浴揮干乙醇，用水將沉淀溶解轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，并定容至刻度，搖勻后精密移取1.00 mL于25 mL容量瓶中，用純凈水定容至刻度，搖勻，即得。

1.3.4.3 還原糖的供試品溶液 稱取地參粉末0.5 g(精確至0.000 1 g)于離心管中，加水15 mL，45℃水浴提取60 min，取出放冷，過濾至25 mL容量瓶中，加入8 mL水復(fù)提殘渣，合并上清液并定容至刻度，搖勻，即得。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

2.1.1 總糖和可溶性多糖標準曲線

分別移取0.50、1.25、2.50、5.00、7.50、10.00 mL葡萄糖儲備液于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度搖勻，制得標準系列工作液。分別取1.00 mL于10 mL比色管中，以1.00 mL純凈水作空白對照，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，搖勻，再迅速加入5.0 mL濃硫酸，立即蓋蓋，混勻[13]。置80℃水浴中加熱15 min，取出迅速用流水沖洗冷卻。以空白管校零，于490 nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=0.0101X+0.024 2，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3，在11.71～234.20 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.1.2 還原糖標準曲線

分別吸取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL葡萄糖儲備液于25 mL比色管中，加水至2.00 mL，以2.00 mL純凈水作空白，加入1.5 mL DNS試劑，搖勻，置于沸水浴中加熱8 min，取出迅速用流水沖洗冷卻，用純凈水定容至25 mL，搖勻。以空白管校零，于520 nm處測定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y=0.014 0X-0.033 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，在4.68～46.84 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗

精密吸取1.00 mL總糖、可溶性多糖和還原糖供試品溶液(S1)各6份，分別按照“2.1.1”和“2.1.2”項下進行顯色測定其吸光度，計算RSD值分別為0.06%、0.32%和0.25%，表明精密度良好，符合分析要求。

2.2.2 重復(fù)性試驗

取地參粉末(S1)按“1.3.4”項下對應(yīng)的方法制備供試品溶液，每個組分平行6份，再分別按照“2.1”項下對應(yīng)的方法測定吸光度，得總糖、可溶性多糖和還原糖的RSD值分別為0.82%、2.33%和1.40%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取1.00 mL總糖、可溶性多糖和還原糖供試品溶液(S1)各1份，分別按照“2.1.1”和“2.1.2”項下方法操作，每隔10 min測定吸光度，連續(xù)6次，計算RSD值分別為1.63%、2.66%和0.85%，小于3.00%，表明供試品溶液顯色后至少在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 加樣回收率試驗

精密稱取已測得總糖和還原糖含量的地參粉末(S1)0.25 g(精確至0.000 1 g)，取可溶性多糖溶液0.5 mL，各6份，分別加入葡萄糖儲備液適量，按“1.3.4”項下對應(yīng)的方法制備供試品溶液，以“2.1.1”和“2.1.2”項下進行顯色測定吸光度并計算回收率和RSD值。結(jié)果顯示總糖、可溶性多糖和還原糖的平均回收率為94.25%～105.10%，RSD值為0.30%～2.12%，符合分析方法要求。

2.3 樣品測定

精密稱取不同產(chǎn)地共10個地參樣品各0.5 g(精確至0.000 1 g)，每個組分平行3份，分別按“1.3.4”項下對應(yīng)的方法制備供試品溶液，以“2.1.1”和“2.1.2”項下進行顯色測定吸光度，計算總糖、可溶性多糖和還原糖的含量，結(jié)果以±s表示，詳見表2。結(jié)果表明，10批地參樣品中，總糖含量介于39.62%～51.20%之間，平均含量為46.14%，比許泳吉[7]對野生地參中總糖的研究結(jié)果略高，表明地參在栽培過程中予以施肥和人工管理后品質(zhì)更優(yōu)。從地理位置來看，云南大理、騰沖、昆明以及廣西玉林樣品總糖含量相對較高。這是因為西南地區(qū)日照充足，降雨豐沛，地參生長過程中有足夠的光合作用來合成糖類物質(zhì)，因此總糖含量豐富。可溶性多糖含量為15.80%～21.98%，平均含量為18.10%；還原糖含量為1.27%～3.83%，平均含量2.54%。3種糖在不同產(chǎn)區(qū)樣品間存在一定差異，其中以可溶性多糖和還原糖的差別較大，從可溶性多糖來看，產(chǎn)自江蘇沛縣(S9)樣品中可溶性多糖含量最高，是平均值的1.21倍，產(chǎn)自重慶萬州(S1)的地參含量較低，低于平均含量的13%，可溶性多糖作為地參品質(zhì)評價的重要指標，藥理作用的重要角色，在我國地域上呈現(xiàn)出了北方>南方>西南方的趨勢，再次驗證了黃小蘭等[17]前期對地參中多糖的單糖組成的研究結(jié)果；同時，在還原糖方面，以重慶萬州(S1)產(chǎn)區(qū)的含量最高，是平均含量的1.51倍，云南大理(S2)的含量最低，低于平均含量的50%。整體上看，還原性糖與總糖含量呈反比趨勢，總糖含量高的產(chǎn)地，還原性糖含量偏低，總糖含量低的產(chǎn)地，還原性糖含量偏低，這可能與還原性糖的還原性質(zhì)有關(guān)[18]，具體原因有待于進一步探究。

從不同產(chǎn)區(qū)地參中總糖、可溶性多糖和還原糖的組成結(jié)構(gòu)上看，重慶萬州的結(jié)構(gòu)比(成分之間含量的比)為11∶4∶1，廣西玉林(S5)22∶13∶1，山東菏澤為18∶7∶1，云南產(chǎn)區(qū)的3個樣本(S2、S3、S4)平均結(jié)構(gòu)比為38∶13∶1，江蘇產(chǎn)區(qū)的4個不同樣本(S7、S8、S9、S10)平均結(jié)構(gòu)比為15∶7∶1。從不同地參的結(jié)構(gòu)比上發(fā)現(xiàn)，地理緯度相近的云南、廣西產(chǎn)區(qū)和江蘇、山東產(chǎn)區(qū)在3種糖的結(jié)構(gòu)比例上相似度極高，而在我國南方和北方卻表現(xiàn)出較大差異。由此表明糖分的積累跟地理位置、環(huán)境條件等因素有關(guān)。

表2 不同產(chǎn)地地參中總糖、可溶性多糖和還原糖的測定結(jié)果(n=3)

2.4 聚類分析

以總糖、可溶性多糖和還原糖的含量作為變量，采用SPSS 20.0軟件對不同產(chǎn)區(qū)的10批地參樣品進行統(tǒng)計分析，當歐式距離為15時，10批地參被分為3類。其中S2、S3、S4、S5聚為第Ⅰ類；S1、S6、S7、S10聚為第Ⅱ類；S8、S9聚為第Ⅲ類，結(jié)果見圖1。聚類分析將云南以及鄰近的廣西產(chǎn)區(qū)聚為一類，這與它們相近的含量和相似的結(jié)構(gòu)比密切相關(guān)；同時江蘇鹽城(S8)和江蘇沛縣(S9)因其較高的可溶性多糖和還原糖含量被聚為一類，品質(zhì)最佳；另一方面北方的山東菏澤(S6)、江蘇徐州(S7)、江蘇宿遷(S10)與西南方的重慶萬州(S1)存在交叉，沒有完全區(qū)分開，因為這幾個產(chǎn)區(qū)在我國地理位置上同屬北緯30°～35°范圍內(nèi)，日照量接近。從整體上看，5個大產(chǎn)區(qū)10個小產(chǎn)地根據(jù)緯度不同被分成了南北2類，與含量結(jié)果測定相符，表明生態(tài)因子對地參中糖類成分的積累存在一定影響。

圖1 不同產(chǎn)地地參樣品聚類結(jié)果Fig. 1 Clusteranalysis of L. lucidus var. hirtus from different habitats

3 討論

本研究測定還原糖時采用了3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色法，由于此法在不同樣品檢測中波長存在差異，既要考慮是否有最大吸收，同時要兼顧該波長下結(jié)果的穩(wěn)定性[19]，故本試驗分別以DNS試劑作為空白對葡萄糖對照品顯色液、供試品顯色液以及以純水作為空白，對DNS試劑和供試品顯色液在400～800 nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，在兼顧最大吸收和排除干擾的情況下，確定最佳波長為520 nm。通過方法學(xué)考察，該法具有操作簡單、專屬性強、靈敏度高、回收率及精密度良好等優(yōu)點。

還原糖是指具有還原性的糖類，一般是含醛基或酮基的單糖、含醛基的二糖，不僅在有機體的代謝中起著重要作用[20]，其含量的高低更關(guān)系到地參后期加工[21]?？偺鞘撬苄蕴呛退蝗苄远嗵堑目偤?，包括還原糖、測定條件下能水解為還原性單糖的二糖和低聚糖，以及可能部分水解的淀粉。可溶性多糖是地參的主要活性成分，具有抗氧化、降血糖血脂、抗腫瘤以及改善免疫系統(tǒng)的作用。因此，地參中糖類物質(zhì)的含量是其品質(zhì)評價的重要指標。

本試驗對不同產(chǎn)地地參中總糖、可溶性多糖和還原糖的含量進行測定，旨在分析出內(nèi)在規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，糖類物質(zhì)在不同產(chǎn)地間存在差異，以總糖來看，南方的云南和廣西產(chǎn)區(qū)含量較高，平均值為50.17%；以可溶性多糖來看，北方的5個樣品平均含量最高，為18.70%；從還原糖方面看，北方高出南方2倍左右，與西南地區(qū)的重慶萬州相差無幾；從3種糖類物質(zhì)的內(nèi)在結(jié)構(gòu)比上看，緯度為22°～26°的南方產(chǎn)區(qū)結(jié)構(gòu)比更為接近，能很好的聚為一類，緯度為31°～35°的北方、西南方產(chǎn)區(qū)一致性較好，這可能與不同緯度條件下日照的長短有關(guān)。這一檢測結(jié)果，不僅為地參產(chǎn)品的綜合開發(fā)提供了新的思路，而且為其栽培引種指明了方向，還為其結(jié)合三萜類、酚酸類等其他成分指標進行多指標質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。