大孔吸附樹脂法吸附桑葚色素及其穩(wěn)定性研究

許先猛，董文賓，，王芳，張?jiān)鰩?，黃健，3，馬蓉麗

（1.運(yùn)城職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西運(yùn)城044000；2.陜西科技大學(xué)，陜西西安710021；3.運(yùn)城學(xué)院，山西運(yùn)城044000）

桑椹（Mulberry），俗稱桑果，含有豐富的多酚類、黃酮類、維生素、有機(jī)酸、生物堿和礦物質(zhì)等活性成分[1]，桑葚及桑葚提取物具有保護(hù)肝腎、降血壓、控制肥胖、抗血栓、抗腫瘤、抗衰老、抗病毒和提高免疫力等功效[2-4]，且桑葚被我國列為“藥食同源”食品。桑葚通體呈黑紫色或紫紅色，紅色素含量較豐富，色價(jià)高。近年來，天然色素的開發(fā)和研究已成為部分研究學(xué)者的關(guān)注重點(diǎn)[5]。桑椹紅色素是一種天然色素，因著色效果好，在果酒、果汁、飲料、糖果生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)采用有機(jī)溶劑浸提法提取桑葚色素，研究了大孔吸附樹脂法純化桑葚色素工藝，并對(duì)制備和純化的桑葚色素穩(wěn)定性進(jìn)行了測定，以期為桑葚色素提取、純化和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑椹：采自山西省運(yùn)城市桑葚農(nóng)場。

大孔吸附樹脂：西安藍(lán)曉科技有限公司；無水乙醇：天津市紅巖化學(xué)試劑廠；檸檬酸：上?；瘜W(xué)試劑公司；氫氧化鈉、蔗糖、濃鹽酸：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；酒石酸：天津市北方天醫(yī)化工試劑廠；醋酸：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氯化鉀：重慶北培精細(xì)化工廠；阿斯巴甜、木糖醇：山東福田科技集團(tuán)。所有試劑均為分析純。

FD-T-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；BS-224型電子天平：德國SARTORIUS公司；722型可見分光光度計(jì)、752型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-III循環(huán)水多用真空泵：上海亞榮生化儀器廠；HH-Z2恒溫水浴鍋：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TDL-5型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；101-1AB電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；HYG-Ⅱa回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速遙瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；微量移液器：芬蘭Dragonmed公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葚色素提取和大孔吸附樹脂純化

1）桑葚色素提?。喝∵m量桑椹→制漿→準(zhǔn)確稱取→加入80%酸性乙醇溶液（pH 2.0），攪拌均勻→50℃避光水浴提取2 h→取上清液，濃縮→醇沉→過濾→真空濃縮→制得桑葚色素溶液（冷藏備用）。

2）桑葚色素大孔吸附樹脂純化：大孔吸附樹脂預(yù)處理→桑葚色素吸附→桑葚色素解吸→真空濃縮→冷凍真空干燥→桑葚色素凍干粉（室溫25℃、密封、避光保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.2 桑葚色素測定方法

1）pH示差測定法：分別取1 mL桑葚色素溶液樣品置于兩根試管之中，分別加入pH（1.0±0.01）的緩沖溶液與pH 4.5的緩沖溶液，靜置后得到待測液。平行測定 3組，按式（1）和（2）計(jì)算桑葚色素濃度[6]。

式中：ε表示矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；DF表示稀釋因子；MW表示矢車菊花素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；L表示光程，1 cm。以蒸餾水作為參比，用A700nm來消除樣液混濁的影響。

1.2.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

大孔樹脂預(yù)處理參考劉玲翠等[7]方法，稍作改動(dòng)。分別將選用的9種大孔吸附樹脂LX-60、LX-36、LXA-8、LSA-10、LSA-21、XDA-8、XDA-7、LS305、LS300用無水乙醇密封浸泡24 h，蒸餾水沖洗乙醇，用1 mol/L的NaOH浸泡24 h，蒸餾水洗至中性，用1 mol/L的HCl浸泡24 h，以蒸餾水洗至中性后備用。

1.2.4 桑椹色素吸附率、解吸率及吸附量的計(jì)算

桑葚色素吸附率、解吸率和吸附量計(jì)算參照李園園等[8]方法，稍作改動(dòng)。分別準(zhǔn)確稱取30.0g預(yù)處理后的 9 種大孔吸附樹脂 LX-60、LX-36、LXA-8、LSA-10、LSA-21、XDA-8、XDA-7、LS305、LS300 置于 500 mL 具塞錐形瓶中，分別加入200 mL已知濃度的色素溶液，避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩4 h，過濾后，記錄溶液體積，并測定其吸光度計(jì)算桑葚色素濃度。

將吸附色素的樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL的80%乙醇，避光和密封處理，30℃下70 r/min解吸振蕩60 min，過濾后，記錄溶液體積，并測定其吸光度計(jì)算桑葚色素濃度。

桑椹色素吸附率、解吸率及吸附量用以下公式計(jì)算：

式中：C0表示吸附液中色素濃度，mg/L；V0表示吸附液體積，L；C1表示吸附后上清液中色素濃度，mg/L；V1表示上清液體積，L；C2表示洗脫液中色素濃度，mg/L；V2表示洗脫液體積，L。

1.2.5 桑葚色素大孔樹脂吸附

1.2.5.1 桑葚色素大孔樹脂吸附單因素試驗(yàn)考察

選取大孔樹脂吸附時(shí)間、桑葚色素解吸乙醇濃度、桑葚色素解吸時(shí)間、解吸次數(shù)等單因素進(jìn)行試驗(yàn)，考察各因素對(duì)桑葚色素吸附量的影響。

1.2.5.2 桑葚色素大孔樹脂吸附正交試驗(yàn)考察

對(duì)吸附時(shí)間、解吸乙醇濃度、解吸時(shí)間、解吸次數(shù)4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，選取3個(gè)水平，采用L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化。試驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors of the orthogonal test

1.2.6 桑葚色素穩(wěn)定性研究

1.2.6.1 pH值對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性的研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，用蒸餾水溶解制備0.1mg/mL桑葚色素溶液，分別用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié) pH 值分別為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 的桑葚色素溶液，靜置 70 min后，掃描在200 nm～800 nm波長范圍內(nèi)不同pH值條件下桑葚色素最大吸收峰。

1.2.6.2 光照對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，用蒸餾水溶解制備0.1 mg/mL桑葚色素溶液，室溫（25℃）常光下靜置5 d，每天測定色素含量。

1.2.6.3 溫度對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，用蒸餾水溶解制備0.1 mg/mL桑葚色素溶液，將桑椹色素溶液分別置于 20、40、60、80、100 ℃水浴中加熱 5 h，每隔 1 h 測定色素含量。

1.2.6.4 甜味劑對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，分別溶解在濃度為的10%蔗糖、3.5%木糖醇、0.3%阿斯巴甜溶液中，制備0.1 mg/mL桑葚色素溶液，蒸餾水作對(duì)照，室溫（25℃）避光靜置5 d，每天測定色素含量。

1.2.6.5 酸味劑對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性研究

稱取一定量的桑葚色素凍干粉，分別溶解在濃度為2%的醋酸、2%檸檬酸、1%酒石酸溶液中，制備0.1 mg/mL桑葚色素溶液，蒸餾水作對(duì)照，室溫（25℃）避光靜置5 d，每天測定色素含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔吸附樹脂篩選

2.1.1 不同種類大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素的吸附效果

在30℃、避光、密封、搖床轉(zhuǎn)速為70 r/min條件下，LX-60、LX-36、LXA-8、LSA-10、LSA-21、XDA-8、XDA-7、LS305、LS300等9種大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素吸附4 h，大孔樹脂吸附率如圖1所示。

圖1 不同大孔吸附樹脂吸附率Fig.1 The adsorption of different macroporous

由圖 1 可以看出，LX-36、LSA-21、XDA-8、LS-305，4種大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素吸附率較高，吸附率都超過了90%。

2.1.2 不同種類大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素的解吸效果

在30℃、避光、密封、搖床轉(zhuǎn)速為70 r/min條件下，用80%乙醇溶液解吸附60 min，大孔吸附樹脂解吸率如圖2所示。

由圖 2 可以看出，LXA-8、LSA-21、XDA-8，3 種大孔樹脂對(duì)桑葚色素解吸率較高，解吸率都超過了90%。

2.1.3 不同種類大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素吸附量

大孔樹脂對(duì)桑葚色素吸附量如圖3所示。

由圖3可以看出，XDA-8吸附量最高，其吸附量為1.81 mg/g。

圖2 不同大孔吸附樹脂解吸率Fig.2 The desorption of different macroporous

圖3 不同大孔吸附樹脂吸附量Fig.3 The adsorption capacity of different macroporous

綜合考慮 LX-60、LX-36、LXA-8、LSA-10、LSA-21、XDA-8、XDA-7、LS305、LS300 等 9 種大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素的吸附率、解吸率和吸附量3個(gè)因素，大孔吸附樹脂XDA-8效果最好。桑葚色素主要成分為極性物質(zhì)，在極性溶液中溶解度高，XDA-8大孔吸附樹脂是極性樹脂，因此XDA-8大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素吸附效果較為明顯。XDA-8為理想的大孔吸附樹脂，用于桑葚色素的分離和純化。

2.2 桑葚色素大孔吸附樹脂分離純

2.2.1 桑葚色素大孔樹脂吸附單因素試驗(yàn)

2.2.1.1 吸附時(shí)間對(duì)桑葚色素吸附量的影響

桑葚色素溶液和XDA-8大孔吸附樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中避光和密封處理，30℃下70r/min分別振蕩吸附 2、4、6、8、10、12 h，過濾，用 80%乙醇在30℃下70 r/min振蕩解吸60 min，桑葚色素吸附量如圖4所示。

圖4 吸附時(shí)間對(duì)桑葚色素吸附量的影響Fig.4 The influence of adsorption time on the adsorption capacity

由圖4可以看出，震蕩吸附時(shí)間對(duì)XDA-8大孔吸附樹脂的桑葚色素吸附量影響呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢(shì)，震蕩吸附時(shí)間超過4 h后，震蕩吸附時(shí)間對(duì)XDA-8大孔吸附樹脂的桑葚色素吸附量影響不明顯。李瑞琦[9]研究發(fā)現(xiàn)，D101大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附桑葚色素3 h后吸附量趨于平穩(wěn)，吸附達(dá)到飽和，這與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致，本試驗(yàn)選取震蕩吸附時(shí)間為4 h。

2.2.1.2 解吸乙醇濃度對(duì)桑葚色素吸附量的影響

桑葚色素溶液和XDA-8大孔吸附樹脂置于500mL具塞錐形瓶中避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩吸附4 h，過濾，分別用20%、40%、60%、80%、95%乙醇在30℃下70 r/min振蕩解吸60 min，桑葚色素吸附量如圖5所示。

圖5 解吸乙醇濃度對(duì)桑葚色素吸附量影響Fig.5 The influence of desorption ethanol concentration on the adsorption capacity

由圖5可以看出，隨著解吸乙醇濃度的增加，XDA-8大孔吸附樹脂的桑葚色素吸附量影響呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，解吸乙醇濃度80%時(shí)XDA-8大孔吸附樹脂的桑葚色素吸附量最高。解吸溶液為極性溶液，隨著解析溶液乙醇濃度的增加解吸溶液極性有所降低，解吸溶液極性介于水和乙醇之間。當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，解吸溶液極性與桑葚色素極性最為接近，桑葚色素解吸率高，桑葚色素吸附量高，因此本試驗(yàn)選取解吸乙醇濃度為80%。

2.2.1.3 解吸時(shí)間對(duì)桑葚色素吸附量的影響

桑葚色素溶液和XDA-8大孔吸附樹脂置于500mL具塞錐形瓶中避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩吸附4 h，過濾，用80%乙醇在30℃下70 r/min分別振蕩解吸 30、60、90、120、150 min，桑葚色素吸附量如圖6所示。

圖6 解吸時(shí)間對(duì)桑葚色素吸附量影響Fig.6 The influence of desorption time on the adsorption capacity

由圖6可以看出，在大孔吸附樹脂解吸時(shí)間為30 min至150 min范圍內(nèi)，隨著解吸時(shí)間的延長，桑葚色素吸附量呈現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢(shì)。解吸時(shí)間超過60 min后，繼續(xù)延長解吸時(shí)間，桑葚色素吸附量基本沒有變化。這是由于大孔吸附樹脂吸附的桑葚色素量是定量，同時(shí)解吸溶液的解吸能力有限，解吸時(shí)間超過60 min后大孔吸附樹脂中桑葚色素已基本解吸完成，本試驗(yàn)選取解吸時(shí)間為60 min。

2.2.1.4 解吸次數(shù)對(duì)桑葚色素吸附量的影響

桑葚色素溶液和XDA-8大孔吸附樹脂置于500mL具塞錐形瓶中避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩吸附4 h，過濾，用80%乙醇在30℃下70 r/min振蕩解吸 60 min，分別解吸和震蕩 1、2、3、4、5 次，桑葚色素吸附量如圖7所示。

圖7 不同解吸次數(shù)對(duì)多酚得率影響Fig.7 The influence of desorption times on the adsorption capacity

由圖7可以看出，隨著解吸次數(shù)的增加，桑葚色素吸附量呈現(xiàn)平緩增加的趨勢(shì)，不同解吸次數(shù)對(duì)桑葚色素吸附量影響不明顯。

2.2.2 桑葚色素大孔樹脂吸附正交試驗(yàn)

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，桑葚色素大孔樹脂吸附正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)表Table 2 The orthogonal range analysis table

結(jié)果顯示，影響桑葚色素吸附量的因素大小依次為 RB＞RC＞RD＞RA，即解吸乙醇濃度＞解吸時(shí)間＞解吸次數(shù)＞吸附時(shí)間，桑葚色素大孔樹脂吸附最佳工藝為A2B2C3D3，即吸附時(shí)間為4 h、解吸乙醇濃度為80%、解吸時(shí)間為80 min、解吸次數(shù)3次。

2.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取30.0 g XDA-8大孔吸附樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL色素溶液，避光和密封處理，30℃下70 r/min分別振蕩吸附4 h，過濾。將吸附色素的樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL的80%乙醇，避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩80 min，解吸3次，過濾后，記錄溶液體積，重復(fù)3次取平均值。結(jié)果表明XDA-8大孔吸附樹脂桑葚色素吸附量為1.89 mg/g。

2.3 桑椹色素穩(wěn)定性研究

2.3.1 pH對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性影響的研究

調(diào)整桑葚色素溶液pH值，靜置70min后，在200nm～800 nm波長范圍內(nèi)掃描桑葚色素最大吸收峰，結(jié)果如表3所示。

表3 pH值對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性的影響Table 3 Effects of pH on stability of mulberry pigments

由表3可以看出，當(dāng)桑葚色素溶液pH 1.0和桑葚色素溶液為pH2.0時(shí)桑葚色素最大吸收峰在535 nm處，在桑葚色素溶液pH2.0至桑葚色素溶液pH6.0范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，桑葚色素最大吸收峰發(fā)生一定位移的紅移。在桑葚色素溶液pH7.0至桑葚色素溶液pH14.0范圍內(nèi)，桑葚色素?zé)o最大吸收峰。這主要是由于桑葚色素溶液pH值升高會(huì)導(dǎo)致桑葚色素中花色苷結(jié)構(gòu)改變，pH值超過6.0且繼續(xù)升高，花色苷中的黃烊鹽陽離子失去質(zhì)子，花色苷中的醌式堿不斷增加，花色苷中醌式結(jié)構(gòu)為主體[10-11]。桑葚色素溶液pH值持續(xù)升高，還會(huì)導(dǎo)致堿式結(jié)構(gòu)出現(xiàn)開環(huán)降解[12]。因此，桑葚色素在pH 2.0左右的酸性環(huán)境較為穩(wěn)定。

2.3.2 光照對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性研究

將0.1 mg/mL桑葚色素溶液室溫（25℃）常光下靜置5 d，每天測定色素含量，結(jié)果如圖8所示。

圖8 光照對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of light on stability of mulberry pigments

由圖8可以看出，桑葚色素在不加入其他試劑的條件下隨著在常光下靜置時(shí)間的延長，桑葚色素的含量不斷降低，因此桑葚色素在常光照射下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，這與張國棟等[13]研究結(jié)果一致，因此桑葚色素保存及應(yīng)用應(yīng)注意避光處理。

2.3.3 溫度對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性研究

將0.1 mg/mL桑葚色素溶液分別置于20、40、60、80、100℃水浴中，避光加熱5 h，每隔1 h測定色素含量，結(jié)果如圖9所示。

圖9 溫度對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effects of temperature on stability of mulberry pigments

由圖9可以看出，溫度變化對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性有一定的影響，在20℃至60℃溫度范圍內(nèi)，在5 h內(nèi)溫度對(duì)桑葚色素穩(wěn)影響不大。當(dāng)溫度為80℃至100℃時(shí)，溫度會(huì)破壞桑葚色素結(jié)構(gòu)。桑葚色素長時(shí)間處于超過80℃溫度下，桑葚色素含量會(huì)大幅度降低。

2.3.4 甜味劑對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性研究

制備含10%蔗糖、3.5%木糖醇、0.3%阿斯巴甜的0.1 mg/mL桑葚色素溶液，室溫（25℃）避光靜置5 d，每天測定色素含量，結(jié)果如圖10所示。

由圖10可以看出，常用的蔗糖、木糖醇、阿斯巴甜等甜味劑在一定的濃度下對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性影響不明顯，食品加工過程中甜味劑的正常使用不會(huì)對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響。

圖10 甜味劑對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effects of sweeteners on stability of mulberry pigments

2.3.5 酸味劑對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性研究

制備含2%的醋酸、2%檸檬酸、1%酒石酸的0.1 mg/mL桑葚色素溶液，室溫（25℃）避光靜置5 d，每天測定色素含量，結(jié)果如圖11所示。

圖11 酸味劑對(duì)桑椹色素穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effects of acidified agent on stability of mulberry pigments

由圖11可以看出，常用的醋酸、檸檬酸、酒石酸等酸味劑在一定的濃度下對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性影響不明顯。桑葚色素在酸性條件下比較穩(wěn)定，通過酸味劑的添加和使用，可以對(duì)桑葚色素起到護(hù)色和增色的效果[14]，食品加工過程中酸味劑的正常使用不會(huì)對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性產(chǎn)生較大影響。

3 結(jié)論

大孔吸附樹脂法吸附桑葚色素，效果良好。XDA-8大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素吸附率、解吸率和吸附量較高，對(duì)桑葚色素吸附量為選取9種大孔吸附樹脂中最高，吸附量為1.89 mg/g。

XDA-8大孔吸附樹脂對(duì)桑葚色素，解吸乙醇濃度對(duì)吸附量影響最大，解吸時(shí)間、解吸次數(shù)、吸附時(shí)間對(duì)吸附量影響逐漸遞減。XDA-8大孔吸附樹脂吸附桑葚色素最優(yōu)工藝為：準(zhǔn)確稱取30.0 g XDA-8大孔吸附樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL色素溶液，避光和密封處理，30℃下70 r/min分別振蕩吸附4 h，過濾。將吸附色素的樹脂置于500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL的80%乙醇，避光和密封處理，30℃下70 r/min振蕩80 min，解吸3次。

桑椹色素穩(wěn)定性研究表明，pH值、光照和溫度等條件對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性影響較大，堿性環(huán)境、光照和高溫都會(huì)破壞桑葚色素結(jié)構(gòu)。桑葚色素在pH值為2.0左右的酸性環(huán)境較為穩(wěn)定，桑葚色素溶液pH值升高會(huì)導(dǎo)致桑葚色素中花色苷結(jié)構(gòu)改變。桑葚色素在低于60℃溫度環(huán)境下結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，溫度繼續(xù)升高桑葚色素結(jié)構(gòu)也會(huì)被破壞。常用的蔗糖、木糖醇、阿斯巴甜等甜味劑和常用的醋酸、檸檬酸、酒石酸等酸味劑在一定的濃度下對(duì)桑葚色素穩(wěn)定性沒有明顯影響。