頂空固相微萃取茶油揮發(fā)性成分的響應面優(yōu)化

王靜，唐旭曉，張應中，*，王明懷，徐煲鏵，張盟雨

（1.廣東省森林培育與保護利用重點實驗室，廣東廣州510520；2.廣東省林業(yè)科學研究院，廣東廣州510520）

油茶籽油（Camellia oleifera seeds oil）簡稱茶油，是山茶科山茶屬的油茶成熟種子中提取的高品質(zhì)食用油[1-2]，為我國特有的木本食用油脂，其不同品種、種源、加工工藝等因素影響油脂特色風味的形成[3]。油脂的感官評價，即油脂風味是衡量食用油品質(zhì)的重要指標[4-7]，茶油的揮發(fā)性成分對其品質(zhì)影響極大[8]。

食用油揮發(fā)性成分分析方法很多，其中頂空固相微萃取技術(shù)（headspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）可富集樣本中絕大部分揮發(fā)性成分和半揮發(fā)性成分[9-10]，檢測效果受萃取頭、樣品用量、萃取溫度、萃取時間、解析時間等因素影響[11-12]。此外，響應面法作為一種常用的試驗優(yōu)化方法，經(jīng)多因素多水平間的交互分析，擬合各因素多元回歸，獲得多項式函數(shù)，最終預測真實值[13]。目前，結(jié)合SPME技術(shù)和響應面法優(yōu)化分析揮發(fā)性成分的研究有板栗[11]、秈稻[12]、人參[13]等植物，但是，茶油風味研究多集中在采用SPME技術(shù)和氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS），比較不同油茶籽加工工藝[8，14-15]、品種類別[16-17]、生長環(huán)境等對茶油風味物質(zhì)的影響，對茶油揮發(fā)性成分分析的HS-SPME-GC/MS萃取條件優(yōu)化未見報道。

因此，本試驗以油茶籽油為原料，采用響應面法探究HS-SPME對茶油揮發(fā)性成分的最佳萃取條件，以期最大限度地檢測茶油揮發(fā)性物質(zhì)組分和含量，為茶油風味研究提供分析技術(shù)和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

油茶籽：廣東省清遠市連州山馬公司提供，經(jīng)曬干后，于陰涼干燥處保存。

1.2 儀器與設(shè)備

QP2020型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）：島津色譜儀器有限公司；SAAB-57330U型頂空固相微萃取手動進樣手柄、SAAB-57300U 型 100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB 和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭：上海安譜實驗科技股份有限公司；AR423CN型分析天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：上海洪紀儀器設(shè)備有限公司；BOZY-01G型家用榨油機：樂清市韓皇電器科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 頂空固相微萃取

油茶籽經(jīng)140℃控溫榨油機螺旋壓榨成油茶籽油，取20 mL茶油于40 mL隔墊密封樣品瓶中，置于一定溫度水浴鍋中預熱。將萃取頭在GC/MS進樣口250℃老化3 min后，插入頂空樣品瓶進行懸空富集，一定時間后取出萃取頭，于GC/MS中解析、檢測。

1.3.2 GC/MS分析條件

GC柱箱溫度40℃、進樣口溫度250℃、進樣方式為不分流、進樣時間1.0 min、流量控制方式為線速度、壓力49.7 kPa、總流量54.1 mL/min、柱流量1.0 mL/min、線速度36.1 cm/sec、吹掃流量3.0 mL/min、分流比50.0。MS離子源溫度230℃、接口溫度280℃、溶劑延遲時間1.0 min?？偝绦驎r間為52.0 min。當溫度升至40℃時，保持1.5 min，然后4℃/min速率升至230℃，保持3.0 min。

1.3.3 油茶籽油揮發(fā)性成分檢測的單因素試驗

比較不同材料涂層萃取頭（100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、萃取溫度（40、50、60、70、80 ℃）、萃取時間（20、30、40、50、60 min）、解析時間（2、3、4、5、6 min）4 個因素對茶油揮發(fā)性成分檢測的影響，分別以揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量為指標，獲得最佳單因素萃取條件。

1.3.4 響應面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken Designexpert中心組合試驗設(shè)計原理，以檢測所得揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量為響應值，單因素試驗最佳值為中心點，進行三因素三水平的組合設(shè)計，并通過響應面分析得到最佳萃取條件。

單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以萃取溫度（50、60、70℃）、萃取時間（20、30、40 min）和解析時間（1、3、5 min）為自變量，以揮發(fā)性化合物數(shù)量為響應值，采用Design-expert軟件設(shè)計三因素三水平的分析試驗，響應面因素及水平見表1。

表1 響應面試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.5 樣品檢測和數(shù)據(jù)分析

茶油樣品經(jīng)HS-SPME-GC/MS分析，通過計算機標準譜圖庫美國國家標準技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST05）檢索篩選相似度80%以上的化合物，并進行分類比較。

根據(jù)響應面試驗結(jié)果獲得的最佳萃取條件，對茶油樣品揮發(fā)性化合物進行驗證，計算預測值與驗證值的偏差，并以總峰面積為指標，按峰面積歸一化法計算各化合物的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 萃取頭對茶油揮發(fā)性成分萃取效果的影響

在 40 ℃水浴下，分別采用 100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 3種不同材料涂層的萃取頭進行頂空固相微萃取30 min，于GC/MS上解析3 min后檢測分析，結(jié)果如表2所示。

表2 不同萃取頭對茶油揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的比較Table 2 Comparison of extraction effect of different fibers head on volatile compounds in Camellia oil

由表2可知，100 μm PDMS所萃取到的茶油揮發(fā)性物質(zhì)種類較單一，數(shù)量較少，僅有24個，其中烷類化合物達18個，原因可能是PDMS只對非極性或弱極性化合物的萃取能力較強[13]，對其他化合物的萃取能力較弱。65 μm DVB/PDMS 和 50/30 μm DVB/CAR/PDMS均萃取到較多揮發(fā)性成分，其中醛類化合物較多，分別為16和28個，其他化合物萃取種類較均衡，由此可見，混合極性的纖維涂層具有更好的萃取效果。DVB/CAR/PDMS萃取效果最佳，檢測出最多揮發(fā)性物質(zhì)59個；其次為PDMS/DVB萃取頭，檢測出47個揮發(fā)性物質(zhì)。因此，確定50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭進行后續(xù)試驗。

2.1.2 萃取溫度對茶油揮發(fā)性成分萃取效果的影響

選用50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，分別在40、50、60、70℃和80℃不同溫度水浴中進行頂空固相微萃取30 min，GC/MS解析3 min，檢測結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同萃取溫度對茶油揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的比較Fig.1 Comparison of extraction effect of different temperature on volatile compounds in Camellia oil

由圖1可知，隨著萃取溫度的上升，揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量呈先增加后減少的趨勢。隨著溫度的升高，氣體分子在有限的樣品萃取瓶中的運動速度加快，縮短了在萃取頭上的吸附平衡時間，溫度60℃時萃取效果達到最佳，檢測出茶油揮發(fā)性物質(zhì)63個；之后隨著溫度的升高，揮發(fā)性物質(zhì)與涂層間的分配系數(shù)下降[18]，從而纖維頭吸附量逐漸降低。因此，選擇樣品萃取溫度范圍為50℃～70℃，進行響應面優(yōu)化試驗。

2.1.3 萃取時間對茶油揮發(fā)性成分萃取效果的影響

選取50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取頭，在40℃水浴中，分別頂空固相微萃取 20、30、40、50 min 和 60 min，再于GC/MS上解析3 min，檢測結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同萃取時間對茶油揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的比較Fig.2 Comparison of extraction effect of different time on volatile compounds in Camellia oil

由圖2可知，隨著萃取時間的延長，檢測出茶油揮發(fā)性化合物的數(shù)量呈先上升后下降再略有上升的趨勢。萃取30 min為最佳萃取時間，此時揮發(fā)性物質(zhì)在氣相和涂層兩相之間達到最佳平衡[18]，共檢測出56個揮發(fā)性化合物；之后隨著時間的延長，萃取出揮發(fā)性化合物逐漸減少，其原因可能是30 min時萃取頭纖維涂層的吸附達到飽和，萃取時間過長導致熱穩(wěn)定性低的物質(zhì)開始分解成小分子化合物[12]。另外，60 min時萃取揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量略有升高，原因可能是受熱分解后的小分子化合物開始吸附于萃取頭材料，此時檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)可能已不是茶油香氣成分。因此，選擇樣品萃取時間范圍為20 min～40 min進行響應面優(yōu)化試驗。

2.1.4 解析時間對茶油揮發(fā)性成分萃取效果的影響

選擇50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，在40℃水浴中進行頂空固相微萃取30 min，于GC/MS儀器上分別解析 2、3、4、5 min 和 6 min，結(jié)果如圖 3 所示。

圖3 不同解析時間對茶油揮發(fā)性物質(zhì)萃取效果的比較Fig.3 Comparison of resolution effect of different time on volatile compounds in Camellia oil

由圖3可知，隨著解析時間的增加，茶油揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量呈先增加后減少的趨勢，在解析時間3 min時，揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量最多達41個，因此，最佳解析時間為3 min。同時，選擇樣品解析時間為1 min～5 min進行響應面優(yōu)化試驗。

2.2 響應面法優(yōu)化

2.2.1 響應面試驗結(jié)果及優(yōu)化分析

根據(jù)響應面試驗方案設(shè)計，使用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭進行不同萃取溫度、時間和解析時間的頂空固相微萃取，于GC/MS上檢測分析，試驗結(jié)果見表3。

表3 響應面試驗設(shè)計和結(jié)果Table 3 Results and design of response surface methodology

續(xù)表3 響應面試驗設(shè)計和結(jié)果Continue table 3 Results and design of response surface methodology

利用Design ExpertV8.0.6.1軟件對表3結(jié)果進行二元多次回歸統(tǒng)計分析，建立回歸模型，此模型得出茶油揮發(fā)性化合物數(shù)量與各變量因素之間的擬合方程為：Y=-303.218 75+8.075A+8.400B-7.375C-0.020AB+0.175AC+0.137 5BC-0.063 75A2-0.121 25B2+1.156 25C2，方差分析結(jié)果見表4。

表4 響應面試驗回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation of response surface experiment

模型P值為0.033 1＜0.05，模型呈顯著差異；總決定系數(shù)R2=0.847 8，校正決定系數(shù)R2adj=0.652 2，殘差平方和為224.25，模型中決定系數(shù)越接近1、殘差越小，其擬合程度越高[13]，因此本模型擬合程度較高；失擬項P=0.864 5（＞0.05）不顯著，響應值Y的變異系數(shù)CV=9.57%，說明試驗誤差較小；信噪比為6.306＞4，表明模型擬合性很好。綜合方差分析各參數(shù)結(jié)果，本響應面優(yōu)化模型具有可行性。

回歸方程的方差分析結(jié)果表明，二次項中萃取時間B對茶油揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量的影響極其顯著（P=0.003 2＜0.01），3個影響因素的一次項和交互項不顯著（P＞0.05）。萃取條件各因素對響應值的影響由大到小為萃取時間B>萃取溫度A>解析時間C，兩兩交互作用的響應面及等高線如圖4所示。

圖4 萃取溫度、萃取時間、解析時間交互作用影響的響應面Fig.4 Response surface of the interaction of extraction experiment，time and resolution time

對回歸模型進行預測得到固相微萃取法分析茶油揮發(fā)性物質(zhì)的最佳條件為萃取溫度70℃、萃取時間31.1 min、解析時間3 min，預測茶油揮發(fā)性物質(zhì)檢測數(shù)量為68.189個。

2.2.2 模型驗證

在響應面試驗基礎(chǔ)上，選擇萃取溫度70℃、萃取時間31 min、解析時間3 min進行模型驗證。此萃取和解析條件下，最終測得茶油揮發(fā)性化合物數(shù)量為70個，茶油中各類揮發(fā)性成分及相對含量見表5，與預測值的相對誤差為2.66%，說明建立的數(shù)學模型具有良好的預測性和準確性，利用響應面法優(yōu)化得到的HSSPME萃取條件方法可靠性高、具有應用價值。

2.3 茶油揮發(fā)性成分分析

萃取條件優(yōu)化后的HS-SPME-GC/MS技術(shù)分析茶油揮發(fā)性成分，經(jīng)80%以上相似度篩選，共獲得70種揮發(fā)性化合物，其結(jié)果見表5。

表5 茶油中各類揮發(fā)性成分及相對含量Table 5 Volatile components and their relative contents in Camellia oil

續(xù)表5 茶油中各類揮發(fā)性成分及相對含量Continue table 5 Volatile components and their relative contents in Camellia oil

續(xù)表5 茶油中各類揮發(fā)性成分及相對含量Continue table 5 Volatile components and their relative contents in Camellia oil

由表5可知，經(jīng)響應面優(yōu)化后，HS-SPME-GC/MS檢測出茶油揮發(fā)性成分共70個，總峰面積為2.16×107，包括醛類、酮類、酯類、烷烴類、醇類、酸類和萜烯類。其中醛類化合物數(shù)量最多，有16種，且相對含量也最高，達39.95%；酮類、酯類和烷烴類化合物數(shù)量均為12種，其相對含量分別為7.42%、3.07%和6.87%；醇類和萜烯類分別含有7和5種揮發(fā)性化合物，相對含量分別6.50%和2.47%；酸類化合物種類僅為6種，但相對含量高達33.70%，其中辛酸、庚酸和壬酸相對含量較高，分別為13.56%、9.70%和9.20%。因此，醛類和酸類化合物為茶油的主要揮發(fā)性成分。

壬醛和辛醛是油酸的氧化裂解產(chǎn)物，壬醛具有花香、脂肪香、蠟香和甜桔香氣，辛醛高濃度呈粗油脂味、低濃度有甜橙、蜂蜜香氣[19]，本研究茶油樣品中相對含量分別有11.13%和2.80%。己醛和庚醛是亞油酸的氧化裂解產(chǎn)物，己醛具有強烈的青草香、水果香等，庚醛有類似甜杏、堅果香氣，其相對含量分別為3.55%和 0.73%。（E）-2-癸烯醛、反-2-十一烯醛、（E，E）-2，4-十二醛、2，4-癸二烯醛和（E）-2-壬烯醛的相對含量分別有8.12%、6.53%、1.68%、1.64%和1.41%。茶油中油酸和亞油酸含量較高，醛類物質(zhì)在茶油中含量也較高，因此醛類對茶油風味起主導作用，與鐘培培等[1]、李梓銘等[14]、朱曉陽等[17]、姚佳寧[20]研究結(jié)果一致。

酮類揮發(fā)性物質(zhì)主要來源于多不飽和脂肪酸的熱降解或β-氧化，茶油樣品中雜環(huán)類化合物較多，1-（2，2-二甲基環(huán)戊基）-乙酮相對含量為1.34%，呋喃類如 5-丁二氫-2（3H）-呋喃酮和二氫-5-戊基-2（3H）-呋喃酮相對含量有1.44%和1.36%。酯類化合物成分也較多，但各物質(zhì)相對含量較低（≤0.64%）。烷烴類化合物占總揮發(fā)性化合物17.14%，其中癸烷、十六烷和二十一烷相對含量較高，分別為1.22%、1.00%和1.83%。醇類化合物具有植物芳香，可與醛類物質(zhì)和脂肪酸等發(fā)生反應，進而影響茶油整體風味[16]，1-庚醇和1-辛醇相對含量分別有2.25%和1.98%，該茶油樣品具有甜味、焦糖香味等。植物油中揮發(fā)性酸類主要來自羥基裂解，具有奶酪味、酸味、辛辣味等，庚酸（9.70%）和壬酸（9.20%）相對含量較高，辛酸（13.56%）呈腐敗味、辛辣味等，說明試驗茶籽樣品已存放一定時間，開始出現(xiàn)不良風味、品質(zhì)下降。此外，萜烯類化合物中8-甲基-1-十一烯相對含量為1.27%。因此，復雜多元的化合物組成和化合物之間的相互影響，共同構(gòu)成了茶油的獨特風味。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應面法優(yōu)化，結(jié)合頂空固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術(shù)獲得茶油揮發(fā)性物質(zhì)的最佳萃取條件：50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、萃取溫度70℃、萃取時間31 min、解析時間3 min。此條件下檢測出茶油揮發(fā)性成分共70種，總峰面積為2.16×107，其中醛類和酸類相對含量最高，其次為酮類、烷烴類和醇類，酯類和萜烯類相對含量較少。采用GC/MS檢測技術(shù)，響應面法優(yōu)化HS-SPME對茶油的萃取，驗證試驗結(jié)果與預測值的相對誤差為2.66%，說明模型可靠，本方法不僅提高了茶油揮發(fā)性化合物的檢測種類，也為茶油特征香氣成分的基礎(chǔ)研究提供了安全、高效、節(jié)能的分析方法。