TLR9聯(lián)合CD40信號對ITP患兒外周血中IL10+CD3-細胞亞群改變的研究

鄭蒙蒙，施建棟，周海霞

（1.溫州醫(yī)科大學 科研實驗中心 流式細胞技術平臺，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童血液科，浙江 溫州 325027）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是兒童常見的出血性疾 病[1]，病情嚴重的患兒可發(fā)生內(nèi)臟甚至顱內(nèi)出血而危及生命，病死率為1%～3%[1-2]。ITP的病因多樣，機體免疫耐受狀態(tài)的失衡是導致該病發(fā)生的重要機制，其中由血小板受體與T細胞受體的相互交叉免疫反應引發(fā)T/B細胞針對自身抗原的異?；罨?，而觸發(fā)一系列免疫反應，并最終引發(fā)ITP的相關機制研究較多[2-3]。此外，感染、妊娠、藥物和遺傳因素等也與ITP發(fā)病有著密切關系[2，4]。然而，由于兒童免疫細胞的發(fā)育和應答與成人免疫系統(tǒng)存在一定的差異，目前有關兒童ITP發(fā)病原因尚未完全明確。IL-10是一種具有免疫抑制功能的細胞因子，巨噬細胞、樹突狀細胞、調(diào)節(jié)性T/B淋巴細胞（Treg/Breg）等均能表達抑炎因子。血小板除了具有經(jīng)典的促凝血功能外，也能表達多種功能受體包括TLR和CD40L[5]。血小板來源的CD40L能促進T細胞效應功能、抑制樹突狀細胞分化、促進B細胞分化及抗體類別改變[6-8]。在血小板減少的過程，機體會增加促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）的合成。而在ITP體內(nèi)模型中，內(nèi)毒素刺激介導的TLR4信號能刺激TPO的合成[9]。但TLR9激動劑（CpG）聯(lián)合CD40L對ITP患兒CD3-細胞的IL-10表達及存活率的影響尚不清楚。本研究通過流式細胞多因子分析技術（CBA）檢測ITP患兒血漿IL-10含量，并通過CpG聯(lián)合CD40L體外刺激ITP患兒和正常對照PBMC，流式細胞胞內(nèi)外染色分析CD3-、CD3+、CD3-IL10+細胞的比例及細胞存活率等，為闡明兒童ITP的發(fā)病機制及探索新的潛在治療靶點和預后指標提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本及資料：選取經(jīng)確診的ITP患兒8例（男5例，女3例），中位年齡4歲，所有患兒均為初發(fā)，診斷符合原發(fā)性ITP[10]，均無肝炎病毒、巨細胞病毒、EB病毒感染依據(jù)，自身免疫抗體均陰性。ITP患兒外周血樣本于治療前采集于溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童血液科，該過程經(jīng)過患兒監(jiān)護人知情同意并且通過溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會審查。同時選取7名年齡性別匹配的健康體檢兒童正常外周血作為對照組。

1.1.2 材料試劑：IMDM細胞培養(yǎng)液和1 000×β巰基乙醇均購于美國Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液（100×）購于上海碧云天生物技術公司；新生牛血清（FBS）購于杭州四季青生物技術公司；紅細胞裂解液和人外周血淋巴細胞分離液均購于北京索萊寶生物技術公司；CpG（OND2006）購于美國Invivogen公司；CD40L購于美國eBioscience公司；流式細胞胞內(nèi)染色試劑盒及Golgiplug均購于美國BD Bioscience公司；LEGENDplex人炎癥因子檢測陣列、FITC anti-human CD3及PE anti-human IL-10均購于美國Biolegend公司；LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit購于美國Invitrogen公司。

1.2 人外周血血漿及PBMC分離 人外周血樣本使用EDTA抗凝管進行采集，外周血樣本先利用PBS稀釋混勻，再緩慢加入人外周血細胞分離液，2 500 r/min 室溫離心20 min，小心吸取管中云霧狀薄層細胞及血漿層，并分別轉(zhuǎn)移至干凈離心管，含有細胞的離心管再加入4倍體積PBS洗滌2次后重懸于IMDM完全培養(yǎng)基進行細胞計數(shù)。

1.3 PBMC體外刺激培養(yǎng) 將計數(shù)后的PBMC按4× 105/孔的細胞密度置于96孔細胞培養(yǎng)板中，并按照實驗條件，設置僅Golgplug作用組（未刺激組）或加入終濃度為10 μg/mL CpG聯(lián)合1 μg/mL CD40L（含Golgplug）為刺激組。將上述細胞置于37 ℃二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 h。

1.4 流式細胞染色及分析 刺激后的細胞重懸于含2% FBS的PBS（FACS緩沖液）中，加入FITC antihuman CD3及LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell染料，冰上染色30 min進行細胞表面抗原的染色。染色后樣本用FACS緩沖液離心洗滌2次后，再按BD胞內(nèi)染色試劑盒說明書配制PE anti-human IL-10，然后進行胞內(nèi)抗原的染色。染色后的細胞將用于流式分析。ITP患兒及正常對照血漿樣本中IL-10的含量采用LEGEND plex技術進行染色，染色方法按照Biolegend LEGENDplex試劑盒說明書進行。染色后樣本將用于流式檢測分析。

1.5 統(tǒng)計學處理方法 流式多因子染色數(shù)據(jù)采用Biolegend公司LEGENDplexTM軟件進行分析處理和作圖。流式細胞胞內(nèi)外染色數(shù)據(jù)采用Flowjo 9.3.2分析作圖，其他數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0作圖和統(tǒng)計學分析。所有流式數(shù)據(jù)采用BD FACSAria II流式細胞儀進行采集，每個樣本收集10～15萬個細胞。2組計量資料比較采用獨立樣本t檢驗或配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患兒外周血血漿IL-10含量檢測結(jié)果 流式細胞多因子檢測技術分析了7例正常對照和8例患兒血漿中IL-10的含量，結(jié)果顯示，相比正常對照組（5.677±0.808），ITP患兒血漿中IL-10的含量（8.063±0.892）顯著升高，其IL-10含量約為正常對照組的1.42倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 CpG聯(lián)合CD40L體外刺激前后ITP患兒PBMC中CD3+和CD3-細胞亞群的變化 采用CpG聯(lián)合CD40L體外刺激7例正常對照和8例ITP患兒PBMC樣本，結(jié)果顯示，體外刺激5 h后相比未刺激組，正常對照及ITP患兒CD3-細胞比例均顯著升高，而CD3+細胞比例均下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1-2。

圖1 流式檢測刺激前后PBMC中CD3+及CD3-細胞比例（%）

圖2 刺激前后PBMC中CD3+及CD3-細胞比例統(tǒng)計圖

2.3 CpG聯(lián)合CD40L體外刺激前后ITP患兒PBMC中IL-10+CD3-細胞亞群的變化 通過流式細胞胞內(nèi)外染色技術進一步分析CD3-細胞中IL-10表達情況，發(fā)現(xiàn)ITP患兒刺激前，其PBMC中IL-10+CD3-細胞比例（0.697±0.056）相比正常對照組（0.521±0.044）有升高，約為正常對照組的1.34倍，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而CpG+CD40L刺激5 h后，正常對照組及ITP患兒IL-10+CD3-細胞比例（2.723± 0.358）相比正常對照組（0.796±0.068）均顯著升高，且相比正常對照刺激后樣本，體外刺激后的ITP患兒PBMC中IL-10+CD3-細胞比例升高更為明顯，約為正常對照組的7.6倍，提示ITP患兒PBMC對于CpG聯(lián)合CD40L體外刺激誘導CD3-表達IL-10可能更為敏感，見圖3-4。

圖3 流式檢測刺激前后PBMC中IL-10+CD3-細胞比例（%）

圖4 刺激前后PBMC中IL-10+CD3-細胞比例統(tǒng)計圖

2.4 CpG聯(lián)合CD40L體外刺激前后ITP患兒PBMC中IL-10+CD3-細胞存活率變化 進一步采用可固定的活細胞分析染料（Live/Dead Fixable Violet Dye）檢測CpG聯(lián)合CD40L刺激前后對PBMC中IL-10+CD3-細胞存活率的影響。我們發(fā)現(xiàn)，刺激后正常對照組和ITP患兒PBMC中IL-10+CD3-細胞存活率均顯著低于未刺激組，ITP患兒IL-10+CD3-細胞存活率均低于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖5-6。

3 討論

ITP是成人和兒童常見的血液疾病，該病最早于1915年由Frank報道。ITP發(fā)病原因復雜，誘導因素亦較多。成人患者中多見于諸如自身抗體及CD8+細胞毒性T細胞介導的抗血小板免疫反應導致巨噬細胞和樹突狀細胞活化并吞噬血小板功能，導致成人患者血小板含量下降。大約有70%的ITP患者中存在抗GP IIb/IIIa抗體，有20%～40%的ITP患者中存在抗GP Ib復合物抗體[11]。另外，有研究也發(fā)現(xiàn)，輔助型T細胞（Th）如Th1/Th2/Th17/Th22型CD4+T細胞比例異常[12]、調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）數(shù)量的失衡和功能異常[13]、濾泡樣輔助性Tfh異常增殖導致B細胞分化和抗血小板抗體生成異常等也參與了該病的發(fā)生[14]。然而，對于非T細胞（CD3-的免疫細胞，如髓系細胞、B細胞等）如何參與該病發(fā)生，尤其對于兒童ITP發(fā)病的影響仍未完全明確。

圖5 流式檢測刺激前后IL-10+CD3-細胞存活率情況（%）

圖6 刺激前后IL-10+CD3-細胞存活率統(tǒng)計圖

以往報道中發(fā)現(xiàn)ITP成人患者編碼IL-1、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、TGF-β和IFN-γ等細胞因子的基因存在較多的SNP位點，且這些SNP位點與ITP的發(fā)生存在較大的相關性[15-19]。雖然，在以往成年ITP患者的研究中發(fā)現(xiàn)成年ITP急性活動期患者外周血血清中IL-10水平低于健康對照及處于臨床穩(wěn)定期的ITP成年患者[20]。然而，本研究通過LEGEND plex多因子檢測技術分析了8例ITP患兒和7例正常對照的血漿樣本的IL-10含量，發(fā)現(xiàn)ITP患兒樣本中IL-10的含量顯著高于正常患兒，該結(jié)果與成人患者血清樣本中的IL-10變化趨勢存在差異，提示ITP患兒中可能存在某些機制能誘導IL-10的表達。血小板表面的CD40L已被認為是導致T細胞異?；罨霸黾訕渫粻罴毎裙δ艿闹匾蛩豙21]，成人ITP患者樹突狀細胞的TLR9 mRNA的異常表達可能也與該病的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系[22]。因此，本研究中，我們進一步應用TLR9激動劑（CpG）并聯(lián)合CD40配體，共同體外刺激8例ITP患兒和7例正常對照PBMC，利用流式細胞胞內(nèi)外染色技術檢測發(fā)現(xiàn)，刺激后ITP患兒和正常對照中CD3-細胞亞群比例均顯著上調(diào)，提示TLR9和CD40L體外聯(lián)合刺激5 h即能導致影響CD3-細胞比例的變化。相比正常對照，ITP患兒在CD3-細胞中IL-10+細胞的比例顯著增高，表明ITP患兒CD3-細胞對于TLR9和CD40信號的刺激可能更為敏感，結(jié)果提示ITP患兒PBMC的CD3-細胞中TLR9及CD40信號可能存在異常。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)ITP患兒PBMC中CD3-細胞對TLR9聯(lián)合CD40L刺激介導的IL-10表達相比正常對照更為敏感。在將來的研究工作中，通過探索ITP患兒中CD3-陰性細胞中響應TLR9和CD40L信號免疫細胞類型和作用機制，以深入闡明ITP的發(fā)病機制。