左旋含羞草堿對(duì)人咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞凋亡及DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

向銀洲，李雪軍，鄒玉華，周華軍

（臺(tái)州市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 臺(tái)州 318020）

鐵是人體生命活動(dòng)中不可或缺的重要元素，參與細(xì)胞呼吸、DNA合成和細(xì)胞周期代謝、細(xì)胞排毒等[1]。鐵離子在氧化還原狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，不僅損害脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，還導(dǎo)致氧化損傷DNA[2-4]。因此，鐵是細(xì)胞生理功能必不可少的物質(zhì)，同時(shí)也存在潛在的毒性。鐵能夠通過(guò)促進(jìn)形成自由基而使腫瘤的發(fā)生加速，也可以作為營(yíng)養(yǎng)元素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，提示鐵及鐵代謝途徑可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。左旋含羞草堿是一種植物氨基酸，研究發(fā)現(xiàn)其與胸腺嘧啶的結(jié)構(gòu)具有高度相似性，能夠與腺嘌呤在復(fù)制點(diǎn)形成氫鍵，二者具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[5]。左旋含羞草堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并通過(guò)螯合鐵離子阻斷癌細(xì)胞周期進(jìn)程，對(duì)人咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，而對(duì)正常肝細(xì)胞的凋亡幾乎沒(méi)有影響[6-7]。本研究通過(guò)觀察鐵與左旋含羞草堿對(duì)咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞凋亡的影響，以及DNA損傷相關(guān)蛋白在凋亡過(guò)程中的變化，探討左旋含羞草堿促進(jìn)咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 左旋含羞草堿購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；人咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞株由武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科研究所提供；p-ATM鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司；p-ATR鼠抗人單克隆抗體、p-mTOR鼠抗人單克隆抗體購(gòu)于上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：人咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞配制成密度為105個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，每孔0.5 mL， 均勻加入到6孔板中，添加適量RPMI 1640培養(yǎng)液，置含5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，次日取出放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，每孔分別加入終濃度為0、100、200、 400 μmol/L的左旋含羞草堿培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h后，取出放在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)FaDu細(xì)胞的凋亡：選擇枸櫞酸鐵銨的實(shí)驗(yàn)濃度分別為0、100、500、 1 000 μmol/L，分別加入FaDu細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞。加入-20 ℃預(yù)冷70%乙醇固定細(xì)胞30 min，放進(jìn)4 ℃冰箱冷藏過(guò)夜。次日取出細(xì)胞，傾去乙醇，PBS洗滌細(xì)胞3次，加入100 μmol/L 的RNA酶200 μL消化細(xì)胞，37 ℃恒溫水浴箱水浴 30 min，滴加20 μmol/L碘化丙啶PI 1 mL，放進(jìn)4 ℃ 冰箱并遮光染色30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)枸櫞酸鐵銨對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響。另一組實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FaDu細(xì)胞分為對(duì)照組，左旋含羞草堿組，終濃度為200 μmol/L（E組），枸櫞酸鐵銨組，終濃度分別為50 μmol/L（A組），100 μmol/L（B組），左旋含羞草堿+枸櫞酸鐵銨組，終濃度分別為左旋含羞草堿200 μmol/L+枸櫞酸鐵銨50 μmol/L（C組），左旋含羞草堿200 μmol/L+枸櫞酸鐵銨100 μmol/L（D組），培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞30 min，放進(jìn)4 ℃冰箱過(guò)夜。次日取出細(xì)胞，按上述方法檢測(cè)枸櫞酸鐵銨、左旋含羞草堿對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響。以上實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以0.9%氯化鈉溶液作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)FaDu細(xì)胞活性：FaDu細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞配成104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，按150 μL、1 500個(gè)/孔的標(biāo)準(zhǔn)將細(xì)胞接種于96孔板，放置到含5% C02、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按上述分組，并設(shè)置陰性對(duì)照孔，每種濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。測(cè)定每孔pH后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時(shí)取出培養(yǎng)板加入CCK-8試劑10 μL繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處OD值，并按照以下公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率:腫瘤細(xì)胞的抑制率（%）=（對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值）/對(duì)照孔OD值×100%[8]。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并描繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.4 Western blot法檢測(cè)p-ATR、p-histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR等DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)：將FaDu細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以每瓶105個(gè)細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放5% CO2、 37 ℃、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，加入左旋含羞草堿，終濃度分別為0、100、200、400 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，離心5 min，倒去上清液，PBS液洗滌3次，分別轉(zhuǎn)移到1.5 mL Ep管中，100 μL蛋白質(zhì)裂解液Buffer被加入EP管處理細(xì)胞，-20 ℃冰箱保存待測(cè)。次日10% SDS-PAGE處理細(xì)胞樣品，SDS聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，4 ℃冰箱封閉過(guò)夜。次日取出硝酸纖維素膜放進(jìn)含一抗抗體的封閉液中，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。次日取出膜電轉(zhuǎn)液洗滌3次，每次10 min。將膜放入含辣根酶標(biāo)記的相應(yīng)IgG二抗抗體的封閉液中，室溫下孵育2 h，電轉(zhuǎn)液洗滌3次，每次10 min。最后將膜放在保鮮膜 上，電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)p-ATR、p-Histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用表示，多個(gè)樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)了24 h、48 h的人咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，見(jiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，連接緊密，密集成片生長(zhǎng)，輪廓欠清，透明度大，折光性強(qiáng)，大小均勻。經(jīng)不同濃度的左旋含羞草堿作用后，可見(jiàn)兩種細(xì)胞相互離散，細(xì)胞皺縮，體積變小，間隙增寬，細(xì)胞固縮深染，折光性減弱，細(xì)胞數(shù)目明顯減少。隨著左旋含羞草堿濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)瓶中懸浮細(xì)胞增多，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞減少，培養(yǎng)液變渾濁。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)FaDu細(xì)胞的凋亡 枸櫞酸鐵銨（濃度分別為0、100、500、1 000 μmol/L）分別干預(yù)FaDu細(xì)胞48 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率分別為（1.75±0.31）%、（ 1.07±0.28）%、（ 2.12± 0.42）%、（ 2.46±0.49）%，結(jié)果顯示FaDu細(xì)胞在100 μmol/L枸櫞酸鐵銨作用下，其凋亡率低于對(duì)照組；500、1 000 μmol/L枸櫞酸鐵銨作用下，F(xiàn)aDu細(xì)胞的凋亡率則高于對(duì)照組，與100 μmol/L的枸櫞酸鐵銨組比較，細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。對(duì)照組和A-E組的細(xì)胞凋亡率分別為（1.78±0.33）%、（ 1.19±0.27）%、（ 1.09±0.25）%、（1.81±0.32）%、（ 1.71±0.30）%、（ 2.95±0.52）%，E組FaDu細(xì)胞凋亡最顯著，C組和D組與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A組和B組與對(duì)照組比，細(xì)胞凋亡率減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 CCK-8檢測(cè)FaDu細(xì)胞的活性 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞分組培養(yǎng)后，在24 h、48 h、72 h、96 h取出檢測(cè)細(xì)胞的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E組對(duì)FaDu細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用最顯著，然后為C組、D組，與對(duì)照組比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

2.4 左旋含羞草堿對(duì)FaDu細(xì)胞p-Histone-H2AX、p-ATR、p-ATM、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響 FaDu細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，分別加入含左旋含羞草堿濃度為0、100、200、400 μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞，Western blot檢測(cè)不同濃度左旋含羞草堿對(duì)人咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，隨著左旋含羞草堿濃度的遞增，p-ATR蛋白的表達(dá)降低，p-Histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。見(jiàn)表1。

圖1 不同濃度枸櫞酸鐵銨對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響

圖2 左旋含羞草堿聯(lián)合枸櫞酸鐵銨對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響

圖3 CCK-8檢測(cè)左旋含羞草堿聯(lián)合枸櫞酸鐵銨對(duì)FaDu細(xì)胞活性的影響

3 討論

腫瘤細(xì)胞表面存在較多轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，這使轉(zhuǎn)鐵蛋白可能成為化療藥物治療腫瘤的靶點(diǎn)。有實(shí)驗(yàn)將點(diǎn)突變的白喉毒素與腫瘤細(xì)胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合形成復(fù)合物，形成內(nèi)吞囊泡而轉(zhuǎn)移進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，從而選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞；另一方面，白喉毒素與腫瘤細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體喪失了原來(lái)的功能，影響了腫瘤細(xì)胞鐵代謝，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。以轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為靶點(diǎn)的化療藥物在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和活體實(shí)驗(yàn)中都顯示出對(duì)腫瘤細(xì)胞較好的細(xì)胞毒性[9]。

鐵螯合劑通過(guò)螯合細(xì)胞內(nèi)鐵影響了癌細(xì)胞生物學(xué)行為，抑制了核糖核苷酸還原酶活性，進(jìn)而影響 DNA的合成和修復(fù)；降低了細(xì)胞周期蛋白CyclinA、CyclinB、CyclinD的表達(dá)，增加了細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDKs）抑制劑、P27Kip1的表達(dá)，降低了CDK2的表達(dá)，降低了Rb磷酸化水平和上調(diào)p53基因和代謝抑制基因NDRG1的表達(dá)，還影響缺氧誘導(dǎo)因子α（hypoxia inducible transcription factor α，HIF-α）的表達(dá)。鐵螯合劑能夠上調(diào)DNA損傷誘導(dǎo)基因（GADD）家族諸多成員mRNA水平和蛋白水平，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。FaDu細(xì)胞在100 μmol/L枸櫞酸鐵銨作用下，細(xì)胞的凋亡率低于對(duì)照組；500、1000 μmol/L枸櫞酸鐵銨作用下，F(xiàn)aDu細(xì)胞的凋亡率則高于對(duì)照組，與100 μmol/L枸櫞酸鐵銨組比較，細(xì)胞凋亡率有顯著性差異，表明一定量的枸櫞酸鐵銨對(duì)FaDu細(xì)胞的凋亡具有抑制作用，缺鐵或鐵過(guò)量對(duì)細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用。左旋含羞草堿能夠促進(jìn)FaDu細(xì)胞的凋亡，加入適量的枸櫞酸鐵銨后，左旋含羞草堿促進(jìn)FaDu細(xì)胞凋亡的作用基本消失。CCK-8法檢測(cè)FaDu細(xì)胞的活性，結(jié)果顯示左旋含羞草堿單獨(dú)作用于FaDu細(xì)胞，其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)作用顯著，加入一定量的枸櫞酸鐵銨后，其抑制FaDu細(xì)胞生長(zhǎng)的作用明顯減弱。這些實(shí)驗(yàn)表明左旋含羞草堿誘導(dǎo)人咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的作用是通過(guò)干擾癌細(xì)胞的鐵代謝來(lái)實(shí)現(xiàn)的，表現(xiàn)出鐵螯合劑的作用。與KULP等[7]的左旋含羞草堿通過(guò)鐵螯合作用阻斷人乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程，發(fā)揮其抗腫瘤作用的研究結(jié)果基本一致。

表1 左旋含羞草堿對(duì)FaDu細(xì)胞p-Histone-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-mTOR蛋白表達(dá)的影響

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于酵母和哺乳動(dòng)物體內(nèi)，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期等方面發(fā)揮著重要的作用[11]。在許多腫瘤中，mTOR信號(hào)通路的異常改變是最常見(jiàn)的病理變化之一，mTOR信號(hào)通路過(guò)度激活可導(dǎo)致癌細(xì)胞的異常生長(zhǎng)、增殖和存活[12]。因此mTOR信號(hào)途徑的失調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，p-mTOR在咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)與左旋含羞草堿作用濃度呈顯著正相關(guān)，推測(cè)左旋含羞草堿促進(jìn)咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡可能通過(guò)AKT/mTOR信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。

DNA損傷是指在DNA復(fù)制過(guò)程中，外源性和內(nèi)源性的因素引起核苷酸序列發(fā)生了永久性變化，從而導(dǎo)致了遺傳特征的改變，其損傷形式多樣，雙鏈斷裂是DNA損傷的一種類型[13]。抑癌基因ATM（ataxia telangiectasia mutated kinase）在DNA雙鏈損傷時(shí)，阻止細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期而發(fā)揮抑癌作用。 p-ATM（phospho-ATM protein）是Ser1981磷酸化的ATM蛋白，主要感應(yīng)和識(shí)別內(nèi)源性和外源性誘變因子造成的DNA雙鏈斷裂損傷[14]。DNA雙鏈斷裂能夠促使ATM發(fā)生自動(dòng)磷酸化，從而激活A(yù)TM激酶[15]，因此p-ATM的表達(dá)水平與DNA雙鏈斷裂損傷的狀況相關(guān)。實(shí)驗(yàn)中，隨著左旋含羞草堿作用濃度的增加，p-ATM蛋白表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明雙鏈斷裂引起的DNA損傷加劇，左旋含羞草堿可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞鐵代謝的干擾，導(dǎo)致DAN雙鏈斷裂，引起DNA損傷，促進(jìn)了FaDu細(xì)胞的凋亡。

組蛋白H2AX在細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)、基因組穩(wěn)定性的維持、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)調(diào)控和腫瘤生長(zhǎng)的抑制中發(fā)揮極其重要的作用，尤其是檢測(cè)H2AX的磷酸化過(guò)程中形成的γ-H2AX，在評(píng)估DNA損傷中具有很大的價(jià)值[16]。而DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)H2AX的迅速磷酸化，是DNA損傷誘導(dǎo)的早期應(yīng)答。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p-Histone-H2AX的表達(dá)與左旋含羞草堿的濃度呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示左旋含羞草堿可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞鐵代謝誘導(dǎo)人咽鱗狀細(xì)胞癌FaDu細(xì)胞DNA的雙鏈斷裂損傷，從而導(dǎo)致染色質(zhì)斷裂、細(xì)胞突變，最終引起細(xì)胞凋亡。

左旋含羞草堿可能通過(guò)干擾人咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的鐵代謝，調(diào)控AKT/mTOR等信號(hào)通路，引起細(xì)胞DNA的雙鏈斷裂損傷，發(fā)生細(xì)胞突變，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。