廣西典型高砷區(qū)蜈蚣草根圍叢枝菌根真菌多樣性研究

蔡榕樹，王艷，孟德凱，趙寧寧，顧明華，王學禮*

1.廣西大學農(nóng)學院/廣西農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室，廣西 南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，廣西 南寧 530007

砷污染是中國突出且亟待解決的環(huán)境問題，其污染現(xiàn)狀十分嚴峻（史振環(huán)等，2015）。廣西南丹縣砷總儲量和采出量均居全國前列，砷渣存量2.7×105t，占地面積高達4.1×105m2，導致大范圍的土壤砷污染，農(nóng)產(chǎn)品安全出現(xiàn)問題，威脅人類生命安全，砷污染治理刻不容緩（Sarwar et al.，2017；胡志剛等，2018）。植物修復技術(shù)因具有經(jīng)濟有效、生態(tài)協(xié)調(diào)、環(huán)境友好等特點而頗受青睞（段志斌等，2016），蜈蚣草（Pteris vittataL.）是砷超富集植物，具有生長快、生物量大、地理分布廣、適應(yīng)性強的特點，在砷污染環(huán)境的修復方面具有良好的應(yīng)用前景（陳同斌等，2002），但如何提高蜈蚣草的修復效率是當前面臨的主要問題。許多研究表明叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi）可以提高蜈蚣草的生物量及對砷的吸收轉(zhuǎn)運，提高其在中輕度砷污染土壤上提取效率（趙寧寧等，2017）。搞清楚礦區(qū)特別是高砷礦區(qū)及周邊蜈蚣草根區(qū)土壤AM真菌的資源狀況，可為篩選出促進蜈蚣草生長及砷吸收的優(yōu)良AM真菌菌株打下基礎(chǔ)。

針對AM真菌資源調(diào)查及多樣性研究方面國內(nèi)已有報道。李東偉（2012）、康前（2018）在礦區(qū)植物根際中均發(fā)現(xiàn)了較高的AM真菌孢子密度和物種豐度，在高濃度重金屬環(huán)境中，AM真菌與植物依舊可以形成良好共生關(guān)系。且但多樣性調(diào)查的對象主要為當?shù)爻Ｒ姷膬?yōu)勢植物如硬毛南芥（Arabis hirsuta），白檀（Symlocos paniculata）、倒掛刺（Rosa longicuspis）等植物根區(qū)的AM真菌，國內(nèi)對砷污染區(qū)AM真菌資源多樣性調(diào)查鮮見報道，對于高砷地區(qū)蜈蚣草-這種特殊的超富集植物根區(qū)的 AM 真菌物種豐度、多樣性等尚不清楚。因此本研究對廣西南丹縣砒霜廠舊址周邊地區(qū)蜈蚣草根圍土壤中AM真菌的多樣性及群落組成進行調(diào)查，以期明確蜈蚣草根區(qū)AM真菌資源狀況，研究結(jié)果將為南亞熱帶地區(qū)優(yōu)良AM真菌菌株的篩選、重金屬污染土壤的植物-微生物聯(lián)合修復提供指導。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

采樣地點位于廣西南丹縣砒霜廠舊址及周邊地區(qū)。屬于屬亞熱帶季風氣候，年均氣溫16.9 ℃，年均降水量1400 mm左右。2017年6月在砒霜廠舊址及周邊地區(qū)選取5個樣地采集蜈蚣草系及其根圍土壤。從樣地1—5的海拔高度分別為802、517、567、456、462 m。樣地1（S1）為對照樣地，位于距砒霜廠舊址58 km的上風向區(qū)域，蜈蚣草長勢良好。樣地2（S2）位于三宜尾礦庫舊址，蜈蚣草長勢良好，根際土壤伴有少量碎石。樣地3（S3）位于大福樓尾礦庫，樣地4（S4）位于芭林尾礦庫舊址，樣地5（S1）位于灰樂尾砂堆，這3個樣地土壤中的砷濃度依次升高，雖然蜈蚣草長勢良好，但植株較矮小，根際土壤伴有較多砂礫。每個樣地3個重復，3個重復之間兩兩相距約50 m，每個重復隨機選取3株相距3—5 m且長勢良好的蜈蚣草，去掉地表大塊砂石和其他雜物，用酒精消毒過的小鏟沿宿主植物周圍向下挖，采集土層深度為 0—20 cm范圍的根系和根圍土樣約500 g，每個重復的根土樣混合，封口標記。根樣用自來水洗凈保存在FAA固定液中用于測定AM真菌侵染率。根圍土風干后過2 mm篩用于土壤理化性質(zhì)測定、孢子分離、孢子密度統(tǒng)計和AM真菌鑒定。

1.2 理化性質(zhì)測定

根據(jù)《土壤農(nóng)化分析》（鮑士旦，2008）中所述方法測定土壤基本理化性質(zhì)：土壤pH值采用酸度計（梅特勒-托利多SevevMulti型pH計）進行測定；土壤全氮采用半微量凱氏法測定；全磷采用NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定；全鉀采用NaOH熔融-火焰光度法測定；土壤As總量、有效態(tài)砷含量和蜈蚣草植株As含量采用王水消解-氫化物發(fā)生原子熒光光譜法（HG-AFS，AF-610A原子熒光光譜儀，北京瑞利儀器公司）測定。

1.3 AM真菌侵染率測定

蜈蚣草根系染色處理：取出保存在 FAA固定液中的根系，用自來水沖洗，剪成0.5—1.0 cm的根段，放入10 cm帶塞試管中，加20% KOH溶液，90 ℃恒溫水浴1 h。去掉堿液，用自來水沖洗根段，加新配的堿性雙氧水（3 mL氨水、30 mL 10% H2O、567 mL去離子水）室溫下45 min，用自來水沖洗根段，加2% HCl溶液酸化5 min，去掉酸液后滴加5%醋酸墨水溶液（95 mL食醋、5 mL北京牌藍黑墨水）于90 ℃恒溫水浴30 min，倒掉染液，加清水浸泡過夜。挑選100條大小相近的根段制片，在顯微鏡下鏡檢，采用根段法進行侵染率（Ri）測定（Biermann et al.，1981）：

式中，I0表示沒有被侵染的總根段數(shù)，I1表示侵染率為10%的總根段數(shù)，I2—I10依次類推。

1.4 AM真菌孢子分離與密度測定

用濕篩傾析法分離AM真菌孢子。取25 g風干土樣置于大燒杯中，加500 mL水，攪拌均勻，靜置10 s左右，過3層篩（0.8—0.25—0.038 mm）保留下層篩面物；用清水反復沖洗下層篩面物，將篩子上的殘留物收集于直徑10 cm，底部標有小方格的培養(yǎng)皿中。在體視顯微鏡下統(tǒng)計每克風干土樣中所含的AM真菌孢子數(shù)量，測定孢子密度（王幼珊等，2012）。

1.5 AM真菌孢子形態(tài)學鑒定

將經(jīng)過濕篩傾析法分離的孢子進行制片，顯微鏡下觀察孢子形態(tài)和大小、孢子的聚集方式、孢壁結(jié)構(gòu)以及連孢菌絲特征，參考《VA菌根真菌鑒定手冊》（Schenck et al.，1990）、國際AM真菌保藏中心（INV AM）和《中國叢枝菌根真菌資源與種質(zhì)資源》（王幼珊等，2012）以及最新分類系統(tǒng)等的鑒定方法，對AM真菌進行種屬鑒定及分類。

1.6 統(tǒng)計分析方法

通過分析AM真菌的孢子密度、分離頻度、相對豐度、物種豐度、香農(nóng)-威納指數(shù)等來揭示AM真菌的多樣性情況。

孢子密度（Spore Density，SD）：

式中，m表示土壤質(zhì)量；N表示孢子個數(shù)。

分離頻度（Frequency，F(xiàn)）：

式中，St表示AM真菌某屬或種出現(xiàn)的次數(shù)；n表示土樣個數(shù)。

物種豐度（Species Richness，SR）：

式中，S表示AM真菌種類數(shù)目；St表示土樣樣本總數(shù)，即50 g蜈蚣草根際土壤樣本中AM真菌的種類數(shù)。

相對豐度（Relative Abundance，RA）：

式中，NS表示AM真菌某屬或某種孢子數(shù)；Nt表示AM真菌總孢子數(shù)。

Shannon-Wiener指數(shù)（H）：

式中，S指某樣地中AM真菌的種數(shù)；Pi指某種AM真菌的孢子數(shù)占該樣地所有孢子數(shù)的百分比。

實驗數(shù)據(jù)的處理以及圖表等由Microsoft Excel 2013完成，由SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用Duncan檢驗法進行多重比較檢驗處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣地土壤及蜈蚣草的理化性質(zhì)

如表1所示。從S1—S5土壤總砷含量呈遞增趨勢，土壤有效態(tài)砷含量也呈同樣遞增趨勢。不同樣地的土壤pH有較大差異，S2 pH為5.11，是強酸性土壤，除S2外的樣地土壤呈為堿性或弱堿性。S2全氮含量顯著高于其他4個樣地。樣點S5全磷和全鉀含量均最高；樣點 S1全磷和全鉀含量均最低。砷污染樣地的蜈蚣草砷含量顯著高于對照樣地，整體上隨著土壤砷污染濃度的升高而升高。

2.2 AM真菌的侵染狀況及孢子密度

2.2.1 AM真菌的侵染狀況

如圖1所示，不同樣地間，蜈蚣草菌根侵染率有較大差異，其中樣地1和樣地5侵染率較高，分別為76.60%和82.00%；其次為樣地2和樣地4，侵染率依次為28.67%和20.67%；樣地3侵染率最低，僅為 16.67%。從樣地 1—5，菌根侵染率先降低后升高。

2.2.2 AM真菌孢子密度

如圖2所示，不同樣地間孢子密度差異較大，樣地4孢子密度最高，為12.98 ind·g-1，依次是樣地 2：6.56 ind·g-1、樣地 3：3.87 ind·g-1、樣地 1：2.72 ind·g-1，樣地 5 孢子密度最低，僅為 0.68 ind·g-1。樣地1—4孢子密度分別是樣地5孢子密度的4.00、9.65、5.69、19.09倍。

2.3 AM真菌的形態(tài)學鑒定及樣地分布

2.3.1 AM真菌孢子形態(tài)學分類

圖1 不同樣地蜈蚣草侵染率（Ri）Fig.1 The infection rate of Pteris vittata L.in different sites（Ri）

圖2 不同樣地蜈蚣草根圍土壤AM真菌的孢子密度（SD）Fig.2 Spore density in rhizosphere soil of Pteris vittata L.in different sites (SD)

如表2所示在采集的所有土壤樣品中，共分離鑒定出2目3科4屬10種AM真菌。其中7種屬于球囊霉屬Glomus，分別為聚叢球囊霉G.aggrega、白色球囊霉G.albidum、沙荒球囊霉G.deserticila、黃孢球囊霉G.flavisporum、團集球囊霉G.glomerulatum、網(wǎng)狀球囊霉G.reticulatum和地表球囊霉G.versiforme。1種屬于管柄囊霉屬Funneliformis，為縮球囊霉F.constricum。1種屬于近明囊霉屬Claroideoglomus，為近明球囊霉C.claroidem。1種屬于盾巨孢囊霉屬Scutellospora，為黑盾聚孢囊霉S.nigra。

表1 樣地土壤及蜈蚣草的理化性質(zhì)Table 1 Soil and Pteris vittata L physicochemical properties of sites

表2 南丹蜈蚣草根圍AM真菌形態(tài)學多樣性Table 2 Morphological diversity of AM fungi in Pteris Vittata L.root area of nandan

2.3.2 蜈蚣草根圍土壤AM真菌分布狀況

不同樣地蜈蚣草根圍土壤中AM真菌的分布情況見表3。在分離鑒定出的10種AM真菌種中，近明球囊霉、團集球囊霉和地表球囊霉分離頻度最高，為100.00%。聚叢球囊霉、縮球囊霉、沙荒球囊霉、黃孢球囊霉和網(wǎng)狀球囊霉分離頻度最低，均為 20.00%。其中聚叢球囊霉和縮球囊霉為樣地 2的特有種，沙荒球囊霉、黃孢球囊霉和網(wǎng)狀球囊霉為樣地4的特有種。

同一AM真菌物種在不同樣地相對豐度有較大差異。近明球囊霉在樣地1、樣地2和樣地5均有較高的分布，分別占樣地1、樣地2和樣地5的32.35%、28.46%和35.29%；近明球囊霉在樣地3和樣地4有較低的分布，分別占樣地3和樣地4的8.97%和4.64%。

圖3 孢子形態(tài)圖Fig.3 The spore morphological

表3 不同樣地蜈蚣草根圍土壤中AM真菌的分布情況Table 3 AM fungi’s distribution in rhizosphere soil of Pteris vittata L.in different sites

團集球囊霉在樣地3和樣地4有較高的分布，分別占樣地3和樣地4的47.59%和29.79%；團集球囊霉在樣地1、樣地2和樣地5均有較低的分布，分別占樣地1、樣地2和樣地5的13.24%、8.94%和7.84%。不同樣地間相對多度最高的AM真菌也是不同的。近明球囊霉在樣地1和樣地2有最高的分布，為樣地1和樣地2的優(yōu)勢種；團集球囊霉在樣地3和樣地4有最高的分布，為樣地3和樣地4的優(yōu)勢種；地表球囊霉在樣地5有最高的分布，為樣地 5的優(yōu)勢種。黑盾聚孢囊霉在不同樣地間均具有較低的分布，分別占樣地2和樣地4的0.81%和0.62%。

2.3.3 蜈蚣草根圍土壤AM真菌多樣性

如圖4所示，樣地2和樣地4物種豐度最高，均為4.33；其次為樣地1和樣地3，物種豐度分別為4.00和2.67；樣地5物種豐度最低，為2.00。樣地2和樣地4的物種豐度是樣地5物種豐度的2.17倍。

Shannon指數(shù)反映樣地AM真菌多樣性狀況，數(shù)值越大，多樣性越高。如圖 5所示，樣地 1的Shannon指數(shù)最高，為1.21；其次為樣地4、樣地2和樣地3，Shannon指數(shù)依次為1.18、1.02和0.81；樣地5的Shannon指數(shù)最低，為0.66。除樣地4外，樣地1—5 Shannon指數(shù)依次降低。

圖4 不同樣地蜈蚣草根圍土壤AM真菌的物種豐度Fig.4 Species Richness of AM fungi in rhizosphere soil of Pteris vittata L.in different sites

圖5 不同樣地蜈蚣草根圍土壤AM真菌的Shannon指數(shù)Fig.5 Shannon Index of AM fungi in rhizosphere soil of Pteris vittata L.in different sites

3 討論

本研究所調(diào)查的5個不同程度砷污染樣地中的蜈蚣草均能被AM真菌侵染，分離出AM真菌4屬10種，但與Schneider et al.（2013）在巴西砷污染土種分離出6屬23種相比，AM真菌的物種豐度相對較低。這是采用單一宿主植物蜈蚣草作為研究對象的緣故，因為AM真菌對宿主植物具有一定的選擇性（包玉英，2004），宿主植物多樣性在一定程度上決定了AM真菌的多樣性（何斐，2016）。同時重金屬污染土壤中的AM真菌物種多樣性水平相對較低（Khan，2001）。

本研究分離的10種AM真菌中，球囊霉屬7種，管柄囊霉屬1種，近明囊霉屬1種，盾巨孢囊霉屬1種，球囊霉屬占各個土壤樣本的75.31%—99.80%。球囊霉屬是該調(diào)查區(qū)域的優(yōu)勢屬，這與 Wei et al.（2015）在銻污染地區(qū)苧麻根區(qū)土壤的AM真菌多樣性調(diào)查結(jié)果一致。這一結(jié)果可能的原因是球囊霉屬為AM真菌類型最大的群體，生活范圍較寬，可以形成一個龐大的菌絲網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，在脅迫環(huán)境下重建菌絲網(wǎng)絡(luò)能力強，對環(huán)境脅迫有更強的適應(yīng)性（Providencia et al.，2005；Wu et al.，2009）。相較于其它AM真菌僅能通過孢子繁殖，球囊霉屬AM真菌可以通過菌絲片段和菌根根段繁殖（Hassan et al.，2011），更高的產(chǎn)孢能力以及更強的侵染植物的能力提高了其繁殖能力，提高了球囊霉屬AM真菌在重金屬脅迫環(huán)境下的競爭力，促進根外菌絲在重金屬污染土壤中快速生長（Daniell et al.，2011）。

一般認為，植物根圍土壤中AM真菌的物種多樣性與孢子密度應(yīng)是一致的，在重金屬污染嚴重的礦區(qū)，植物根區(qū)土壤中AM真菌的孢子密度與物種豐度之間也表現(xiàn)出了這種相關(guān)性，即孢子密度值較大的土壤，其物種豐度也較高（肖艷萍等，2008）。本研究的侵染率結(jié)果是 S5的侵染率最高，為84.00%，但其孢子密度僅為0.68 ind·g-1，遠低于其他4個樣地；同時S5樣地的物種豐度和物種多樣性也最低，分別為2.00和0.66。侵染率高，但孢子密度低是因為一定量的土壤重金屬雖不能抑制AM真菌與植物形成AM真菌共生體，但對AM真菌的產(chǎn)孢能力具有明顯的影響（梁昌聰?shù)龋?007）。高濃度的砷阻礙了AM真菌的生長繁殖，只有少數(shù)抗壓能力較強菌種的孢子可以抵抗這個不利因子從而在土壤中存活，如本研究結(jié)果中的近明球囊霉、地表球囊霉等，這部分優(yōu)勢AM真菌的孢子具有很強的保護機制和外部菌絲的產(chǎn)生和更新能力，可以適應(yīng)高濃度的重金屬環(huán)境（Patricia et al.，2016），菌絲的快速生長更新能力也使得其具有更高的侵染率。S1中總砷和有效態(tài)砷含量都很低，所以推測蜈蚣草根系侵染最高主要受土壤磷影響，因 S1土壤中的全磷為0.45 g·kg-1，遠低于其他4個樣地，而低磷可以刺激AM真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長從而促進 AM 真菌的侵染（張淑彬等，2017）；同時S1樣地的孢子密度最低可能也受到高海拔的影響，S1的海拔為802 m，顯著高于其他4個樣地（S2—S5海拔高度為462—567 m），海拔升高會影響AM真菌的生長和產(chǎn)孢，明顯低AM真菌孢子密度（Gai et al.，2012）。

AM真菌對環(huán)境的適應(yīng)能力很大程度決定了它的物種豐度及物種多樣性。除S4之外，S1—S5的物種豐度與多樣性總體呈下降趨勢，S4的物種豐度和多樣性分別為4.33和1.21，為S5的2倍左右，孢子密度是5個樣地中最高的，為6.56 ind·g-1。這可能與S4的孢子形態(tài)有關(guān)，AM真菌孢子的形態(tài)差異也影響孢子對砷污染的適應(yīng)能力。S4的孢子如黑盾巨孢囊霉、沙荒球囊霉等顏色深或表面紋飾豐富的孢子多，5個樣地中，團集球囊霉和地表球囊霉等適應(yīng)性較強的菌種分離頻度均達到了100%，相對豐度更高，顏色深、表面網(wǎng)紋間隔致密的AM真菌對砷污染的有更強的抵御能力，顏色深的AM真菌孢子黑色素含量高，砷濃度高的樣地中團球囊霉、地表球囊霉和縮球囊霉的AM真菌孢子的顏色相對砷含量低的樣地偏深，表面網(wǎng)紋更密，對其在礦區(qū)污染環(huán)境下的生存有利，網(wǎng)紋間隔致密的特征更有利于其抵御外界污染物的入侵，減少對其的損害，從而使AM真菌孢子具有更高的活力（李華健等，2019）。

4 結(jié)論

不同程度砷污染土壤中生長的蜈蚣草均能被AM 真菌侵染，隨著砷濃度的增加物種多樣性總體呈下降趨勢。無污染土壤中的AM真菌侵染率和孢子密度主要受土壤磷和海拔的影響。低磷促進孢子萌發(fā)和菌絲生長，從而提高侵染率，而海拔升高會導致孢子密度降低。但隨著土壤砷污染水平的增加，砷濃度逐漸成為主要影響因子，使侵染率上升，孢子密度下降。孢子密度和物種豐富的變化趨勢一致。

共分離出的4屬10種AM真菌，管柄囊霉屬、近明囊霉屬、盾巨孢囊霉屬各1種，其余7種均為球囊霉屬，球囊霉屬是該調(diào)查區(qū)域的優(yōu)勢屬。AM真菌孢子的形態(tài)直接影響的其適應(yīng)能力，顏色深、表面網(wǎng)紋間隔致密的AM真菌抗逆性更好，近明球囊霉、團集球囊霉和地表球囊霉等適應(yīng)性較強的菌種分離頻度達到了100%，相對豐度也相對較高。