基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究西紅花抗炎作用的分子機制

劉克杰，謝國勇，金書屹，秦民堅

(中國藥科大學(xué) 中藥資源系，江蘇 南京 211198)

西紅花(CrocussativusL.)為鳶尾科番紅花屬植物，其原產(chǎn)于伊朗，地中海一帶，后經(jīng)西藏傳入中國，故又稱番紅花或藏紅花[1-2]。藥用部位為干燥的柱頭，因其用途廣泛，且產(chǎn)量極低，導(dǎo)致西紅花的價格一直居高不下[3]。西紅花中主要的活性成分有西紅花苷、西紅花酸和西紅花苦素等，具有鎮(zhèn)靜安神、涼血解毒、抗炎和提高免疫力的功效[4-5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)概念最早由安德魯·霍普金斯2007年在Nature Biotechnology上提出，它在基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上, 通過分析基因網(wǎng)絡(luò)庫、蛋白網(wǎng)絡(luò)庫、疾病網(wǎng)絡(luò)庫、藥物網(wǎng)絡(luò)庫等現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的信息資料，從系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)角度揭示生物系統(tǒng)、藥物成分和疾病之間的復(fù)雜關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強調(diào)系統(tǒng)性、動態(tài)性、多靶點的特征,而中藥方劑中也有“七情配伍”、“君臣佐使”等原則,兩者研究的思路和方式深度契合。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)工具研究和開發(fā)中醫(yī)藥，傳承與創(chuàng)新結(jié)合，有著重要的意義和廣闊的空間[6-8]。

圖1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究西紅花抗炎作用流程圖Fig.1 The flow chart of anti-inflammatory effect of Crocus sativus L. based on network pharmacology

1 試驗和方法

1.1 西紅花化學(xué)成分的收集和處理

通過實驗室前期已經(jīng)確定的化學(xué)成分同時結(jié)合已有的西紅花文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，整理得到西紅花化學(xué)數(shù)據(jù)庫。利用TCMSP(http://tcmspw.com/)數(shù)據(jù)庫，以 Lipinsk類藥性原則和口服吸收利用度(OB≥30%)為標(biāo)準(zhǔn)對西紅花化學(xué)數(shù)據(jù)庫中成分進(jìn)行篩選，利用Chemdraw17.1軟件繪制得到的有效成分的化學(xué)分子式，文件保存為SDF格式[9]。

1.2 西紅花有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選得到的化學(xué)成分上傳至Swiss(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫[10]，得到有效成分對應(yīng)的靶點信息，以Probability值進(jìn)行降序排列，取前20個靶點作為該化合物對應(yīng)的靶點，利用Cytoscape3.4.1構(gòu)建西紅花有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.3 收集相關(guān)抗炎靶點信息并構(gòu)建抗炎靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

在Therapeutic Target Database(TTD, https://db.idrblab.org/ttd/)，Comparative Toxicogenomics Databas(CTD, http://ctdbase.org/)和OMIM(OMIM, https://omim.org/)中以“ant-inflammatory”為關(guān)鍵詞檢索得到相關(guān)抗炎靶點和對應(yīng)的疾病信息，構(gòu)建疾病-抗炎靶點網(wǎng)絡(luò)[11-13]。進(jìn)一步將得到的靶點導(dǎo)入String(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中，得到蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)。

1.4 相關(guān)靶標(biāo)匹配以及成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選得到的有效成分對應(yīng)靶點與疾病對應(yīng)的靶點進(jìn)行匹配，利用Cytoscape3.4.1軟件中Merge功能將有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和疾病-抗炎靶點網(wǎng)絡(luò)合并，合并后得到西紅花有效成分-抗炎靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO富集分析與KEGG pathway分析

利用DAVID Bioinformatics Resources(DAVID, https://david.ncifcrf.gov/) 對成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)中的靶點進(jìn)行基因生物功能學(xué)(GO)富集分析和KEGG pathway富集分析。

2 結(jié)果

2.1 西紅花化學(xué)成分篩選結(jié)果

結(jié)合Lipinsk類藥性原則和口服吸收利用度(OB≥30%)對西紅花化學(xué)數(shù)據(jù)庫中成分進(jìn)行篩選，一共得到21個化學(xué)成分，結(jié)果見表1。21個化學(xué)成分均滿足分子量<500，氫鍵給體數(shù)目≤5，氫鍵受體數(shù)目<10，脂水分配系數(shù)<5，可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量≤10和口服利用度≥30%的要求。

表1 收集得到的21個可用化學(xué)成分

2.2 有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建得到西紅花有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖2。網(wǎng)絡(luò)中共包含節(jié)點205個(其中化合物節(jié)點21個，靶標(biāo)節(jié)點184個)，作用關(guān)系574條。紅色菱形代表西紅花中有效成分，黃色圓形為度值<4的靶點，綠色圓形為度值≥4的靶點。其中度值較高的化合物有西紅花酸、山奈酚、咖啡酸、異鼠李素等；度值較高的靶點有人表皮生長因子受體(EGFR)、人血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)、肝細(xì)胞生長因子受體(MET)、絲裂原活化蛋白激酶12(MAPK12)、單胺氧化酶A(MAO A)、等。試驗統(tǒng)計了度值≥4的靶點信息，結(jié)果見表2。其中，與信號傳導(dǎo)有關(guān)的靶點有EGFR、KDR、MAPK12、MET、FGFR1、SELE、MIF、ERBB2、FLT4、，與代謝過程相關(guān)的靶點有MAO A、MAO B、COX-2、FASN。

2.3 構(gòu)建得到的抗炎相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)

將TTD、CTD和OMIM數(shù)據(jù)庫中篩選得到的抗炎靶點導(dǎo)入Cytoscape3.4.1，得到抗炎-靶點網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3a。利用String11.0在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建得到這些靶點的蛋白質(zhì)互相作用關(guān)系(PPI)網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖3b。圖3a中共有63個與抗炎作用相關(guān)的靶點信息，圖3b為這63個靶點之間的相互作用，其中degree值較大的靶點有腫瘤壞死因子(TNF)、絲裂原活化蛋白激酶12(MAPK12)和人血管內(nèi)皮生長因子受體2(KDR)。

圖2 西紅花有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)Fig. 2 Effective component - target network in safflower

表2 有效成分對應(yīng)的靶點信息

2.4 西紅花化學(xué)成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

將化學(xué)成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和抗炎-靶點網(wǎng)絡(luò)合并得到西紅花化學(xué)成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖4。其中西紅花抗炎活性成分14個，主要有西紅花酸、異鼠李素、山奈酚、咖啡酸、苦藏紅花苷酸、藏花醛等；與西紅花發(fā)揮抗炎作用的靶點有13個，分別是EGFR、KDR、PTPRC、MAPK12、APP、MET、FGFR1、LPAR1、SELE、CD38、MIF、ERBB2、DRD2、FLT4。其中，西紅花酸、異鼠李素、山奈酚主要作用于EGFR和MAPK12; 咖啡酸、苦藏紅花苷酸、藏花醛、3,5-二甲基苯甲醛主要作用于KDR、MET和FGFR1。從圖4可以看出，西紅花酸、異鼠李素、咖啡酸是西紅花發(fā)揮抗炎作用的主要活性成分，EGFR、KDR、MAPK12、PTGRC、ERBB2為西紅花發(fā)揮抗炎活性的主要靶點。

圖3a 抗炎相關(guān)靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.3a Ant-inflammation - associated target network

圖3b 抗炎靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)Fig.3b Ant-inflammatory target interaction network (PPI)

圖4 西紅花化學(xué)成分-抗炎靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)Fig. 4 Chemical composition - anti-inflammatory target - disease network in safflower

2.5 GO分析結(jié)果和KEGG pathway分析結(jié)果

利用David數(shù)據(jù)庫對預(yù)測得到的抗炎靶點進(jìn)行GO生物功能學(xué)分析和KEGG pathway富集分析，分析結(jié)果見圖5a和圖5b。GO分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點主要分布于內(nèi)膜系統(tǒng)中，分子功能主要集中于蛋白結(jié)合、生物催化等功能上。通過參與生物體內(nèi)細(xì)胞信號的傳導(dǎo)，細(xì)胞代謝和基因表達(dá)等過程，從而發(fā)揮出抗炎的作用[14]。KEGG pathway富集結(jié)果顯示，預(yù)測的靶點主要分布在信號傳導(dǎo)通路以及和癌癥相關(guān)的通路上。與信號傳導(dǎo)有關(guān)的通路有Rap1信號通路(Rap1 signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、RAS信號通路(Ras signaling pathway)鈣信號通路(Calcium signaling pathway)等，與癌癥相關(guān)的通路有乳腺癌(Breast cancer)、前列腺癌(Prostate cancer)、胃癌(Gastric cancer)等。

3 討論

本研究構(gòu)建了西紅花有效成分-靶點-疾病的網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)分析得到了西紅花發(fā)揮抗炎作用的活性成分和靶點。其中與西紅花抗炎作用關(guān)系密切的化學(xué)成分有西紅花酸、異鼠李素、咖啡酸，與抗炎作用關(guān)系密切的靶點有EGFR、KDR、MAPK12、PTGRC、ERBB2，推測西紅花酸、異鼠李素、咖啡酸通過作用于這些靶點，參與了生物體內(nèi)MAPK signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、IL-17 signaling pathway等信號傳導(dǎo)過程，調(diào)節(jié)了血管通透性，影響了炎癥因子的釋放和表達(dá)，最終發(fā)揮了抗炎作用。

圖5a 預(yù)測靶點的GO富集結(jié)果Fig. 5a Predicted target GO enrichment results

圖5b 預(yù)測靶點的KEGG pathway富集結(jié)果Fig. 5b KEGG pathway enrichment results of predicted targets

表皮生長因子受體(EGFR)能與受體酪氨酸激酶(RTK)結(jié)合,當(dāng)EGFR表達(dá)增強時，會促使上皮細(xì)胞生長因子與RTK形成復(fù)合物，影響上皮細(xì)胞增殖和分化，進(jìn)而引起炎癥發(fā)生[15]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)能被多種炎癥因子激活，增加組織細(xì)胞炎癥發(fā)生機率，在炎癥發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用[16]。推測西紅花酸、異鼠李素和咖啡酸通過作用于EGFR、MAPK等靶點，減少了炎癥因子的產(chǎn)生和釋放，抑制了炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)過程，從而發(fā)揮了抗炎作用[16]。動物試驗也表明，西紅花酸和異鼠李素可以有效抑制LPS誘導(dǎo)大鼠腫瘤壞死因子、IL-6、NO的釋放和NF-κB激活，具有顯著的抗炎和抗腫瘤作用[17]。這與本研究預(yù)測的結(jié)果基本一致，表明西紅花中抗炎成分通過相關(guān)靶點影響了生物的代謝信號傳導(dǎo)和相關(guān)酶的表達(dá)，從而發(fā)揮了抗炎和抗腫瘤作用[18]。